[发明专利]使用激光测定酶活性的方法和设备

说明书

相关申请的交叉引用

本发明包含涉及2007年5月28日在日本专利局提交的日本专利申请JP 2007-139891的主题，其整个内容通过引用包含于此。

技术领域

本发明涉及测定酶的活性的方法等。更具体地，本发明涉及使用多光子激发过程来测定酶的活性的方法等。

背景技术

生物化学技术已经完成了组织或细胞中酶活性的测量。首先，一部分组织被取出以制备匀浆，或收获培养细胞以制备溶解产物。接下来，将组织匀浆或细胞溶解产物离心分离，以制备酶活性成分。然后，将作为酶的底物的反应物加到如此制备的酶活性成分中，并测量在底物反应物和酶之间发生反应后生成的底物代谢物的量，从而测量酶活性。

在比色法中，例如，使用能够通过与酶反应进行着色的底物反应物，并确定着色的程度，从而测量酶活性。测量方法的其它例子包括：使用通过与酶进行反应发出荧光的底物反应物，并确定荧光强度，从而测量酶活性的荧光测定法；以及使用具有在与酶反应的过程中可变的吸收波长的底物，并确定吸收率的变化，从而测量酶活性的吸收测定法。

日本特开第2006-34215号描述了细胞色素P450(下文中称为“CYP450”)的制备方法，细胞色素P450是药物代谢酶的代表。除此之外，Analytical Biochemistry 276：214-226，1999描述了利用由该方法等获得的CYP450来测量酶活性。另外，American Society forPharmacology and Experimental Therapeutics DMD 30：845-852，2002和Biochemistry 45：12204-12215，2006分别公开了通过利用使用基因重组的微生物生产的CYP450进行酶活性测量。此外，日本专利特开No.Hei 11-225791描述了给动物使用的药物在体内新陈代谢，并获得动物的尿以获得CYP450的酶活性测量。

发明内容

在根据现有技术测定酶活性的方法中，需要制备组织匀浆或细胞溶解产物以及酶活性成分，这需要麻烦的处理。除此之外，在现有技术的方法中，需要溶解组织或细胞，因此在保持组织或细胞活着的同时测定组织或细胞内的酶的活性非常困难。

因此，需要一种测定酶活性的方法，在该方法中，与根据现有技术的方法相比，可以通过更简单的操作进行测量，且通过该方法，还可以测定体内组织内或体内细胞内存在的酶的活性。

为了满足上面的需要，根据本发明的一个实施例，提供了一种测定酶活性的方法，包括：通过检测从底物或底物代谢物的多光子激发过程生成的辐射波，来测定底物借助酶进行新陈代谢所产生的底物代谢物的量。

优选地，酶活性的测量在这样的条件下进行：底物和底物代谢物中只有一个要通过多光子激发过程生成辐射波。

尤其是，在酶是体内酶的情况下，酶活性测量优选地通过使底物渗透到酶所在的体内位置进行。

另外，根据本发明的另一个实施例，提供一种测定酶活性促进剂或抑制剂的方法，包括：在酶活性促进剂或抑制剂存在时，通过检测从底物或底物代谢物的多光子激发过程生成的辐射波，来测定底物借助酶进行新陈代谢所产生的底物代谢物的量。还提供一种筛选酶活性促进剂和/或抑制剂的方法，包括：在样本存在时，通过检测从底物或底物代谢物的多光子激发过程生成的辐射波，来测定底物借助酶进行新陈代谢时产生的底物代谢物的量。

此外，根据本发明的还一个实施例，提供一种用于测量酶活性的设备，至少包括：激光源，用于生成用以引发底物或底物代谢物的多光子激发过程的近红外飞秒激光束；辐射波检测单元，用于检测从底物或底物代谢物的多光子激发过程生成的辐射波；以及光径，使近红外飞秒激光束通过该光径被引入酶所在的位置，且使辐射波通过该光径被引入辐射波检测单元。

此外，该设备可以包括用于将底物引入酶的存在位置的渗透装置。

根据本发明实施例的测定酶活性的方法尤其适用于酶是药物代谢酶的情况。

现在，下面将给出这里使用的术语的定义。

“多光子激发过程”的意思是一个分子同时吸收多个光子(多光子吸收)，导致跃迁到电子第一激发态或第一激发态之上的现象。可以通过用物镜将飞秒激光束，即脉宽处于从飞秒级到皮秒级的范围(亚皮秒范围)内的激光束会聚到目标分子上引起多光子激发过程。这样激发的分子在返回其原始能态时产生辐射波。通过检测辐射波，可以观察样本中的分子。