[发明专利]微生物混合发酵制备D-泛解酸内酯的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种D-泛解酸内酯的方法，特别涉及用化学合成的DL-泛解酸内酯做底物，用微生物混合发酵制备D-泛解酸内酯的方法。

背景技术

D-泛解酸内酯(pantoyl lactone)是生产泛酸、泛醇以及泛硫乙胺的重要中间体，它与β-丙氨酸反应即得到泛酸。泛酸，Pantothenic acid，又称本多生酸、维生素B₅或B₃，是一种重要的药物、食品添加剂和饲料添加剂。泛酸是维生素B族物质，是辅酶A的组成部分，参与体内脂肪酸降解和合成、柠檬酸循环、胆碱乙酰化、抗体的合成等代谢过程，泛酸的存在有利于各种营养成分的吸收和利用。

由于泛酸对热、碱、酸均不稳定，其产品形式一般为其右旋体钙盐D-泛酸钙。泛酸钙，化学名为N-α，γ-二羟基-β，β-二甲基丁酰-β-氨基丙酸钙，也是一种重要的饲料添加剂，先大量应用于饲料行业。泛酸钙作为维生素饲料添加剂，在畜禽养殖中具有重要的作用，供应不足时会使畜禽出现各种代谢、神经、肠胃等方面生理机能的紊乱。许多国家规定使用D-或DL-泛酸钙，我国只批准使用D-型。生产D-泛酸的中间体泛解酸内酯则要求具有较高光学纯度的D-构型。

D-泛醇(维生素原B₅)，是重要的化妆品和药用原料，市场紧缺。D-泛醇的生产不能采用钙盐诱导结晶法，生物拆分法制备D-泛解酸内酯更有实际意义。

目前制备D-泛酸一般采用化学或生物拆分方法。传统的化学拆分方法存在生产成本高、生产量小、产品光学纯度差等弱点。生物拆分方法中，采用微生物酶法拆分DL-泛解酸内酯，因具有环境污染和毒性少的特点而成为研究的一个重要方向。其中，微生物酶法拆分DL-泛解酸内酯的L-泛解酸内酯，得到未分解的D-构型泛解酸内酯(JPA47-19745、JPA 57-152895)，此法的缺点只有L-构型的内酯被水解的非常彻底才能得到高光学纯度的D-泛解酸内酯，反应时间长，大约需要72小时，长时间的水解过程会导致一部分D-泛解酸内酯水解，因此所得到的产物D-泛解酸内酯收率不高。另一种方法是利用产D-泛解酸内酯酶的微生物，选择性水解DL-泛解酸内酯中的D-泛解酸内酯。该方法水解时间短，虽然水解率不高(30％左右)，但未水解的L-泛解酸内酯可消旋后再利用，产物的总收率高。该法已先后在日本第一制药公司和中国浙江鑫富生化股份有限公司用于工业生产，分别采用尖孢镰孢Fusarium oxysporum IFO 000或串珠镰孢霉菌Fusarium moniliforme CGMCC 0536。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的微生物混合发酵制备D-泛解酸内酯的方法，具有反应时间短，水解程度高，产品纯度高，所筛选到的微生物酶的立体专一性较好，联合作用于DL-泛解酸内酯时可以得到很高光学纯度的D-泛解酸内酯。

本发明的微生物混合发酵制备D-泛解酸内酯的方法，其特别之处在于：采用产D-泛解酸内酯水解酶的微生物菌株土曲霉Aspergillus terrus DH-069-CGMCCNo.2498和米根霉Rhizopus oryzae QY-022-CGMCCNo.2497，作为混合发酵产酶菌株。

本发明的制备D-泛解酸内酯的方法，采用以下步骤：

(1)取权利要求1所述的两种菌株，进行培养，混合发酵，获得湿菌体或经过固定化后的菌丝体作为酶源；

(2)将步骤(1)的酶源加入到DL-泛解酸内酯的底物中反应，生成D-泛解酸，经内酯化，制成D-泛解酸内酯。

上述本发明的制备D-泛解酸内酯的方法，步骤(2)中底物浓度为wt20-50％，菌丝体∶DL-泛解酸内酯＝1∶2(重量比)，酶反应温度为20-40℃，酶解时间为3-30小时。

上述本发明的制备D-泛解酸内酯的方法，步骤(1)所述的酶源中，菌株土曲霉和米根霉的接种量面积均为1cm²。

上述本发明的制备D-泛解酸内酯的方法，步骤(1)中产酶发酵培养的培养基为：蔗糖wt1～5％、蛋白胨wt0.1～2％、酵母膏wt0.1～2％、玉米浆wt0.1～4％，pH值6～8，温度20～30℃，培养3～7天。

本发明采用微生物混合发酵生产的D-泛解酸内酯水解酶，进行酶水解拆分DL-泛解酸内酯的方法得到D-泛解酸，再经过内酯化反应生成D-泛解酸内酯的方法。与已报道的单株微生物拆分DL-泛解酸内酯生产泛解酸法相比，具有更高的经济效益。