[发明专利]两嗅细胞共培诱导嗅干细胞增殖和分化的方法

说明书

所属技术领域

本发明专利涉及一种嗅鞘细胞培养与嗅干细胞联合培养干诱导嗅干细胞分化的方法，获得嗅干细胞分化后的成熟神经细胞，用于中枢神经系统损伤的细胞移植临床治疗。

背景技术

已有报道进行了不同干细胞的体外诱导分化研究，尝试在体外诱导分化后进行细胞移植，但嗅干细胞的诱导分化研究尚少见报道。

发明内容

为了克服中枢神经系统损伤的细胞移植治疗上的难题，本发明专利提供了一种嗅鞘细胞培养与嗅干细胞联合培养诱导嗅干细胞分化方法。在体外诱导分化后，获得嗅干细胞分化后的成熟神经细胞，使用于中枢神经系统损伤的细胞移植临床治疗成为可能。

本发明专利解决其技术问题所采用的技术方案是：体外分离培养人胚嗅鞘细胞，建立人胚嗅粘膜神经干细胞的体外培养方法，获得足稳定传代的嗅干细胞后将其与嗅鞘细胞共同培养，同时设定干细胞培养基组、无血清组。五天后固定细胞，用巢蛋白(Nestin)、微管蛋白(Tubulin)、微管相关蛋白(MAP2)、神经胶质酸性蛋白(GFAP)多种抗体作免疫细胞荧光染色，对阳性细胞进行形态学鉴定。

本发明专利的有益效果是，为嗅神经干细胞的诱导方法，在体外诱导分化后使人胚嗅干细胞应用于中枢神经系统损伤的细胞移植临床治疗成为可能。

具体实施方式

(一)收集妇产科流产和引产的无明显发育障碍的胎儿，分别分离、获取嗅鞘细胞和原代嗅神经干细胞。

(二)试剂培养基(DMEM/F12)，细胞因子(B27)，表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，谷氨酰胺，胶原蛋白酶。

(三)沿死亡胎儿眉弓上开颅，移去脑组织，暴露前颅底，取下嗅球见筛板、鸡冠，于筛板周边切开颅底骨板向鼻腔方向切取两侧鼻腔外侧壁的上、中鼻甲及相对应的鼻中隔中上部分，取下标本放入培养基中清洗数遍以洗去嗅黏膜上的血液，剪碎后加入少量的基础培养基，用弯头吸管将剪碎的组织移入15毫升离心管中，加5毫升基础培养基，用粗弯头吸管上下吹打使之成为组织悬液，离心5min 1000转弃上清；如此重复2次，加入胶原蛋白酶0.5ug/ml用吸管吹匀，放入37℃水浴锅中，消化15min后用吸管轻轻吹打静置1min吸出上清，加入(含10％胎牛血清)培养基的离心管中，如此重复3次基本可以将组织消化为单细胞悬液，将消化终止后的悬液收集一起离心，D/F12清洗3次，用内含表皮生长因子的条件培养基传代培养至少20次以上。

(四)将多次收集的嗅鞘细胞培养基进行0.22μm纤维素膜过滤除菌后替换嗅神经干细胞培养基观察至第5天并进行免疫荧光染色分析。

(五)光镜下前三天观察细胞与对照组无明显变化，第4天和第5天可见细胞突起增多、增殖减慢。免疫荧光染色观察GFAP染色阳性细胞比例明显增加，巢蛋白、微管蛋白阳性细胞降低。