[发明专利]用于转染猪皮肤的嵌合型腺病毒载体及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种用于转染猪皮肤的嵌合型腺病毒载体及其用途。

背景技术

烧伤是一类发生率及致残率均较高的特殊类型创伤，其根本问题就是创面问题，如果烧伤创面得不到及时有效的覆盖、封闭，必将引起患者机体内环境的紊乱、感染及多脏器功能障碍的发生；此外，还可能出现创面的非生理性愈合，使疤痕形成增加，残疾程度加剧。因此，对烧伤创面进行皮肤移植的研究是现代烧伤治疗的迫切需要；也是烧伤研究的热点及难点。

深度烧伤创面需经皮肤移植才能愈合，而大面积、特大面积烧伤患者自体皮源严重不足，需经非自体(同种异体或异种)皮覆盖创面方能取得较好的临床效果，同种异体皮(主要是尸体皮)是目前烧伤创面治疗中公认效果较好的生物敷料，但由于来源和伦理等多种条件限制，同种异体皮无法满足临床需求。猪皮由于与人皮在组织结构和生理功能上的高度相似性，是临床使用最为广泛的异种皮肤，但由于猪和人之间的种属差异，其排斥反应比较严重，无法起到长期覆盖作用。

专利申请号为00103528.2，发明名称是“一种用重组基因转染的异体皮肤”的专利申请公开了利用传统的Ad5腺病毒载体携带免疫抑制基因CTLA4Ig对猪皮肤进行体外转染，可使CTLA4Ig蛋白在猪皮组织活细胞内表达，从而起到抑制免疫排斥的发生，在烧伤创面诱导移植皮肤局部特异性免疫耐受，达到延长移植异种皮肤成活的目的。

但是，Ad5腺病毒载体对猪皮肤组织细胞的感染效率较低，需要较高滴度的病毒感染才能发挥效果，使得基因转染猪皮的生产成本较高。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种用于转染猪皮肤的转染效率高的嵌合型腺病毒载体。

本发明的另一目的是提供该嵌合型腺病毒载体的用途，可用于制备覆盖烧伤创面的转染猪皮肤。

本发明的技术方案如下：

用于转染猪皮肤的嵌合型腺病毒载体，所述嵌合型腺病毒载体是含有与启动子有效连接的CTLA4Ig重组基因的Ad5F35嵌合型腺病毒载体。

所述Ad5F35嵌合型腺病毒载体是一种″改外壳″的嵌合型腺病毒载体(Chimeric adenovirus)，即用Ad35的纤毛小节(Fiber)替代第一代腺病毒5型腺病毒的纤毛小节所致。所述CTLA4Ig重组基因是将CTLA4基因或其片段与Ig部分编码基因融合形成的重组基因。

所述CTLA4Ig重组基因中的CTLA4是人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4分子胞外区部分。用于本发明的CTLA4可以是该分子胞外区全长的CTLA4，也可以是包括其中一部分的CTLA4片段。本发明的CTLA4最好还包括信号肽。所述CTLA4Ig重组基因中的Ig是人免疫球蛋白IgGγ1，其核昔酸序列包括人IgGγ1铰链区、CH1及CH2区；CTLA4Ig重组基因中CTLA4与Ig的相连方式是铰链区连接。优选的用于本发明的CTLA4Ig的重组基因表达序列如SEQ ID NO：1所示。

为了使重组的CTLA4Ig基因在被转化的组织中进行表达，该基因应与可驱动该基因表达的启动子有效连接。所说有效连接是指启动子与重组基因的连接方式可以使该启动子能够引导该重组基因在皮肤细胞中进行表达。本发明中可以使用任何已知的可以在皮肤细胞中引导外源基因表达的启动子。与本发明的CTLA4Ig重组基因表达序列有效连接的启动子包括CMV、CAG、SV40或K14等等。

本发明提供的嵌合型腺病毒载体可用于制备覆盖烧伤创面的转染猪皮肤，用以覆盖临床烧伤病人的烧伤创面，不仅降低了排斥反应，而且大大提高了转染效率，降低了生产成本。在本发明中所述猪皮肤可以是任何一种品系、任何年龄的猪皮肤，优选小于6个月猪龄的巴马香猪皮肤。

本发明成功构建了含有CTLA4Ig重组基因的Ad5F35嵌合型腺病毒载体，以此腺病毒载体对猪皮组织进行转染，与Ad5-CTLA4Ig腺病毒载体转染相比发现可以提高转染效率5-7倍，大大提高了基因转染效率，降低了生产成本。

附图说明

图1为pDC316-CTLA4Ig质粒结构示意图。

图2为pcDNA3-CTLA4Ig质粒经HindIII和XhoI双酶切鉴定图。M1是DNA分子量标准(DL15000)从小到大依次为：250bp、1000bp、2500bp、5000bp、7500bp、10000bp、15000bp；M2是DNA分子量标准(DL2000)；1：HindIII和XhoI双酶切pcDNA3-CTLA4Ig质粒。