[发明专利]重排噬菌体E基因、含有该基因的打孔质粒载体及其应用

说明书

技术领域

本发明公开了一种经基因重排后获得的DNA，尤其涉及一种经基因重排后 获得的PhiX174噬菌体mE基因的DNA，本发明还涉及含有该DNA的打孔质粒 载体及其构建方法，本发明还进一步涉及该孔质粒载体在制备菌蜕中的用途， 属于基因工程领域。

背景技术

细菌菌蜕(Bacterial Ghost)是一种没有细胞浆和核酸的空细菌体。将 PhiX174噬菌体E裂解基因在细菌中表达，该基因编码蛋白在细菌细胞膜和 胞壁上可形成穿膜隧道，在渗透压的作用下使菌体破裂，细菌胞内细胞浆和 核酸成分通过此隧道被排出，形成一种空的细菌外壳，即为“Bacterial Ghost”。 bacterial ghost是由内膜(cytoplasmic membrane)，胞浆间隙(periplasmic space) 和外膜(outer membrane)组成，因此细胞壁在很大程度上被完整保存下来。在 有些菌株的外膜上还有一层S-layer，也成为bacterial ghost的成分之一。 Bacterial Ghost本身可作为一种很好的疫苗，因为它保留了和活菌一样的细菌 胞膜结构和相关抗原蛋白，而外膜含有天然的免疫细胞通过模式识别受体识 别的高度保守结构PAMP(pathogen-associated molecular patterns)，例如脂多糖， 肽聚糖，CPG，OmpA和菌毛等，能有效地被DC和巨噬细胞所吞噬。目前， ghost通过静脉、皮下、气体等途径免疫已经在小鼠、兔子、猪等动物模型中 取得了良好的免疫保护效果。用A.pleuropneumoniae ghosts气体免疫接种猪， 诱导了针对A.pleuropneumoniae引起的胸膜肺炎的完全保护。霍乱菌 ghost(VCG)经皮下注射小鼠诱导血清产生高水平的抗霍乱特异性IgG抗体。 同时显示，针对VCG的抗体足以保护新生小鼠免遭霍乱弧菌的感染。另外， Bacterial Ghost还可以用作一种极好的递送系统，通过在细菌裂解之前对细菌 进行外膜的人工改造，将外来抗原，核酸或药物等其它成分锚定于胞膜的内、 外侧，或充于胞浆周质。这样制备的重组ghost拥有完好的，天然的细菌外膜 结构，能同时激发体液和细胞免疫应答。其菌毛等表面黏附结构，又使之能 靶向黏附在特异性的组织，如胃肠道和呼吸道的黏膜表面，进而较易被机体 吞噬细胞，如PP结(Peyer’s Patches)的M细胞所识别捕获，故而可有效递送 疫苗抗原至黏膜表面和诱发相关黏膜免疫应答。Eko等人将沙眼衣原体 (C.trachomatis)抗原在霍乱菌的内膜表达，然后裂解制备的重组ghost(VCG)有 效地激发了生殖道黏膜的Th1型免疫应答，现在正在着手进入临床实验。与 传统的原核系统表达蛋白相比，重组bacterial ghost有几大优势：(1)重组蛋白 被整合在一个具有高度免疫原性的环境中；(2)对蛋白的大小要求范围宽泛， 但蛋白的分子量最好在2000到200,000Da之间；(3)重组蛋白被直接表达后整 合到细菌的膜上，裂解后就能直接用于免疫动物，而不必要象以前制备免疫 原时要先分离纯化重组蛋白；(4)整合在细胞壁的重组蛋白是以天然的构象， 所以保持了它原有的活性形式。而一般基因重组的蛋白通过原核系统大都以 包涵体的形式表达，只能通过变性、复性的方法在一定程度上恢复蛋白活性。 (5)ghost的制备相对简单，可用发酵技术获得，而不需进行复杂的纯化工作； 可以冻干的形式贮存于室温。

溶解基因E的表达可在λpL/pR-cI857或在lacPO-lacIq启动阻遏系统的转 录控制下完成。一些含有不同抗性标记、复制起始区和基因E表达控制的特 异性溶解质粒已经被构建出来。λpR启动子和温敏阻遏物cI857在30℃以 下能抑制基因E的表达，高于30℃会导致阻遏物cI857热灭活而诱导E基因 表达。为了制备ghost，细菌须在28℃条件下生长到对数生长期，然后升温 到42℃诱导其溶解。

E蛋白介导的溶解已经成功地应用于各种大肠杆菌菌株、鼠伤寒沙门氏菌 和肠炎沙门氏菌等多种细菌，范围如此之大说明了只要E溶解盒被引入到适 当的载体中，E蛋白介导的溶解可能会在每个革兰氏阴性菌中发生。