[发明专利]小立碗藓抗低温胁迫基因PpHap5a-like及其蛋白、和载体

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，具体地，本发明涉及一种小立碗藓抗低温胁迫基因基因PpHap5a-like及其编码的蛋白质、含有该基因的载体、和转基因细胞系。

背景技术

低温、干旱、高盐是限制植物生长发育、地理分布、形态建成等的重要环境胁迫因素。这些胁迫因素作用的结果均导致植物细胞失水，影响植物细胞的渗透压，进而影响植物正常的生理代谢，严重时导致植物的死亡。通过对一些模式植物的研究发现这三种胁迫因素诱导表达的功能蛋白及转录因子相互交差，因此，寻求同时具有忍耐低温、干旱、高盐胁迫的绿色植物来研究植物的非生物胁迫极有必要。

对苔藓植物的基础研究标明：苔藓植物是极地低温度环境的先锋植物之一，同时它也分布在极端干旱的沙漠。在漫长的生物进化历程中，苔藓植物形成了一套独特的适应低温干燥等恶劣环境的机制。对小立碗藓非生物胁迫研究发现(Frank等，2005)，与其他高等植物相比，小立碗藓(Physcomitrella patens)可以忍耐极端的生态环境。如，拟南芥在100mM的NaCl处理下即受到伤害(Sunkar等，2003)，而小立碗藓可以忍耐350mM的NaCl溶液，在缓慢的逐渐提高的盐处理条件下，小立碗藓可以忍耐600mM的NaCl胁迫。500mM的山梨醇处理三天后，小立碗藓仍可以幸存。当小立碗藓失水92％时仍可恢复正常生长发育。在脱水、盐渍和渗透胁迫条件下，Frank等(2003)分析鉴定了一系列上调基因，其编码的蛋白主要有胆碱脱氢酶(choline dehydrogenase)、甜菜碱(glycine betaine)、三氢吡咯羧酸盐(deltal1-pyrroline-5-carboxylate)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、钙依赖蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase)、促分裂素原活化蛋白激酶(MAP kinase)等。在0℃低温胁迫七天后小立碗藓仍可恢复生长(Minami等，2005)，且在冷驯化过程中激活了LEA(late-embryogenesis-abundant)蛋白的转录，提高了其冰冻耐受能力。

因此从苔藓植物中克隆抗逆相关基因并进一步通过转基因等技术应用于提高农作物的抗逆性是目前研究的热点之一。

发明内容

为了解决上述问题提出并完成了本发明。

本发明的目的是提供一种高效的抗低温胁迫相关基因。

本发明的另一目的是提供上述基因编码的蛋白质。

本发明的再一目的是提供含有上述基因的载体。

本发明的再一目的是提供表达上述基因的转基因细胞系。

具体地，本发明的发明人将培养至15叶左右的小立碗藓茎叶体在0℃下经过不同时间的处理与非处理小立碗藓茎叶体组成差异材料，通过cDNA-AFLP技术得到差异表达的EST，随后在分子水平进行表达分析或蛋白质水平的分析，挑选出了一种具有显著抗逆特性的基因-小立碗藓抗逆基因PpHap5a-like，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，其cDNA序列如SEQ ID No.2所示。

进一步，本发明还提供了上述基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

在本发明的完成过程中，还提供了包含上述基因的载体、以及表达该基因的转基因细胞系。

本发明获得的基因具有高效的抗逆性。通过常用的基因工程技术，可以利用该基因培育出优质的转基因农作物，从而提高农作物的抗逆性。

附图说明

图1为PpHap5a-like基因的cDNA-AFLP图谱，其中，Maker：分子量标记；1、未驯化的24小时的材料；2、未驯化的12小时的材料；3、冷驯化的24小时的材料；4、冷驯化的12小时的材料。

图2为PpHap5a-like基因的Real-time RT-PCR相对表达量变化图。

具体实施方式

1、小立碗藓的培养及冷胁迫处理

将小立碗藓培养至15叶左右，移入0℃处理0、3、6、12、24、48、72小时，分别取材用于cDNA-AFLP分析。

附：小立碗藓培养基配方及制备：

大量元素：

Ca(NO₃)₂·4H₂O   0.8g/L

FeSO₄·7H₂O      0.0125g/L