[发明专利]一种检测禽流感疫苗免疫动物的血清中针对禽流感病毒中和抗体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测禽流感疫苗免疫动物的血清中针对禽流感病毒中和抗体的方法。

背景技术

禽流感(avianinfluenza，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒属的禽流感病毒(AIV)引起的一种家禽和野禽的感染或疾病综合征，鸡、火鸡、鸭、鹅和鹌鹑等家禽、野鸟、水禽和海鸟等均可感染。这种高度接触性的传染病可呈无症状感染、不同程度的呼吸道症状、产蛋率下降，以至引起头冠和肉髯紫黑色、呼吸困难、下痢、腺胃乳头和肌胃角膜下等器官组织广泛性出血、胰脏坏死、纤维素性腹膜炎、甚至100％致死率的急性败血症。野鸟或者侯鸟是AIV的自然宿主，现已证实禽流感病毒可以由家禽直接感染人，具有重要的公共卫生学意义。

根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性的不同，可将禽流感病毒分为16个HA亚型和9个NA亚型。其中H5亚型和H7亚型为高致病性禽流感(highly Pathogenic AvianInfluenza，HPAI)，传播迅速、病程短，可引起家禽大批死亡，给养禽业造成严重损失。此外，越来越多的证据表明，HPAIV还可以突破种间障碍，感染人并造成发病和死亡。因此，世界动物卫生组织将HPAI列入必须通报的疾病名录，我国也将其定为一类动物传染病。

按照国际上通行的对动物疫苗的评价方法，必须进行攻毒试验，对于禽流感疫苗来说，也就是说给鸡(动物)先免疫以后，再用毒株进行攻击，看它是否会发病。如果未发病，通过检测血凝抑制抗体和/或保护性抗体也就是中和抗体的效价来确定疫苗的效力大小。传统的禽流感病毒中和抗体的检测主要采用全程细胞培养法，该方法通过观察细胞病变(CPE)判断结果，主观性强；细胞病变一般要通过连续观察5-7天才能最后确定结果，需要时间长；而且高致病性禽流感抗体检测必须在BSL-3实验室进行；一次检测标本量少，难以一次大量检测；该方法难以商品化。

发明内容

本发明提供了一种检测禽流感疫苗免疫动物的血清中针对禽流感病毒中和抗体的方法。

本发明所提供的检测禽流感疫苗免疫动物的血清中针对禽流感病毒中和抗体的方法，依次包括以下步骤：

1)将灭活的待测血清原液进行倍比稀释后，分别与禽流感病毒混合，得到病毒-血清混合物；

2)将步骤1)中的病毒-血清混合物与禽流感病毒的宿主细胞共培养；

3)以抗流感病毒NP蛋白的抗体为一抗，进行酶联免疫反应，确定待测血清中所述禽流感病毒血清中和抗体的效价。

上述步骤2)中，所述禽流感病毒的宿主细胞具体可为MDCK细胞、Vero细胞等。

上述步骤2)中，所述共培养的条件可为在37℃、5％CO₂温箱中培养18-22小时。

上述步骤3)中，所述抗所述禽流感病毒NP蛋白的抗体具体可为单克隆抗体或多克隆抗体。

为了提高检测结果的可靠性，所述方法中设置有阴性血清对照、阳性血清对照、阴性细胞对照和阳性细胞对照。

所述阴性血清对照为未感染禽流感病毒的动物血清；所述阳性血清对照为感染禽流感病毒的动物血清；所述阴性细胞对照为未感染禽流感病毒的宿主细胞；所述阳性细胞对照为感染禽流感病毒的宿主细胞。

本发明的方法可用于初步检测禽流感疫苗的有效性，在实际应用中，可结合其他方法对禽流感疫苗进行综合评价。

本发明所提供的检测禽流感疫苗免疫动物的血清中针对禽流感病毒中和抗体的方法，具有如下优点：

1、检测方法采用细胞培养与ELISA检测方法结合，客观性强，便于标准化。

2、实验可以在36小时内完成，大大缩短了确定结果的时间。

3、该方法不仅可以在BSL-3实验室进行，也可以在BSL-2实验室进行，扩大了实验操作的范围。

4、标本可以进行高通量检测，结果计算有客观的指标。

5、方法中所用的试剂可以装配成试剂盒进行商品化。

6、自制配套试剂，方法稳定可靠。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

附图说明

图1为96孔板布局图。

具体实施方式

本发明所提供的检测禽流感疫苗免疫动物的血清中针对禽流感病毒中和抗体的方法包括病毒中和试验和ELISA检测两个步骤。

病毒中和试验包括：

1)将灭活的血清原液倍比稀释；

2)将步骤1)的血清与200TCID₅₀病毒液等体积比混合；

3)病毒-血清混合物于37℃，5％CO₂反应1小时。