[发明专利]农杆菌介导的小对叶遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种农杆菌介导的小对叶遗传转化方法。

背景技术

小对叶(Bacopa monnieri)是玄参科假马齿苋属多年生沉水草本植物，不仅具有较高的观赏价值，而且还兼有药用之功能。它的自然繁殖系数很低，采用常规方法很难形成规模化的生产。目前主要对小对叶采用组织培养方法，通过叶片进行增殖，在短期内得到大量试管苗，既填补了这一领域的空白，又具有一定的经济价值和药用价值。随着小对叶养殖规模的扩大，迫切需要培育出优良的新品系，以提高产量和品质。因此，培育出抗逆、优质的小对叶新品种成为亟需解决的问题。

目前，基因工程方法是最有效、最快捷、最可靠的新品种培育方法。因此，利用基因工程技术研究小对叶的生物学特性，培育小对叶的新品种成为必然的发展方向。随着组织培养技术、基因重组技术的发展，植物转基因技术得到日益广泛的应用。这无论对于分子遗传学研究或是遗传改良都具有特别重要的意义。自从1984年首次获得转基因烟草以来，植物遗传转化技术迅速发展，目前已经建立了多种遗传转化方法，如农杆菌介导法、基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导法、显微注射法等。其中根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导法是目前研究最多、理论机制最清楚、技术方法最成熟的遗传转化方法。在已获得的近200种转基因植物中约80％是由农杆菌介导法完成的。这一方法的遗传转化率受农杆菌菌株类型、浸染时间、共培养时间、外植体预培养时间等因素的影响。目前，根癌农杆菌介导法的小对叶遗传转化研究还未见报道。

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是源于海洋生物多管水母属(Aequoria Victoria)的一种发光蛋白，能够自身催化形成生色团并在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光，能在活细胞内稳定表达。GFP的荧光反应不需要任何底物及辅助因子，使表达检测非常简单。同时，GFP在细胞中呈自主表达，没有细胞种类、位置和种属的特异性。GFP对受体细胞无毒性，对目的基因没有影响，因而可以很方便的对活体进行观察，来研究GFP基因的表达。由于GFP对光漂白、氧化剂、还原剂、酸、碱以及其它许多化学试剂具有极强的稳定性，因此，GFP可作为报告基因来监测转基因的表达、信号转导、蛋白运输与定位等。

发明内容

本发明的目的是提供一种农杆菌介导的小对叶遗传转化方法。

本发明所提供的一种农杆菌介导的小对叶遗传转化方法，包括如下步骤：以小对叶的叶片为外植体，用处于对数生长期的、OD₆₀₀值为0.4-0.6的目的农杆菌菌液侵染所述外植体5-10分钟；所述目的农杆菌菌液的OD₆₀₀值优选为0.5，所述侵染的时间优选为7分钟。

所述方法中还包括在所述侵染之前，对外植体进行预培养的步骤，所述预培养的时间可为1-3天，优选为2天。

所述方法中还包括在所述侵染之后进行共培养的步骤，所述共培养的时间可为4-6天，优选为4天。

所述方法中还包括在所述共培养之后进行脱菌培养的步骤，所述脱菌培养中所用的培养基可含有450mg/L的头孢霉素。

所述目的农杆菌含有潮霉素抗性基因。

所述方法中在所述脱菌培养后还包括筛选培养的步骤，所述筛选培养的方法包括如下步骤：将所述脱菌培养后的外植体转入含有10mg/L潮霉素的分化培养基中进行培养，分化得到芽。

所述筛选培养方法中还包括如下步骤：将所述分化得到的芽用含有9mg/L潮霉素的生根培养基进行培养。

所述目的农杆菌菌液中可含有100mg/L乙酰丁香酮。

所述共培养的培养基中也可含有100mg/L乙酰丁香酮。

用本发明方法对小对叶进行遗传转化，得到的抗性芽率为7.5％，表明本方法转化效率高。本发明中以水生植物小对叶为实验材料，以报告基因——绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein，GFP)来检测外来基因能否在其中稳定和瞬间表达，为今后建立小对叶遗传转化系统，使外源基因在其中稳定表达奠定了基础，对小对叶的遗传改良有十分重要的意义。另外，绿色荧光蛋白基因的转入，还可以提高小对叶的观赏价值，既美化了环境，又为后续净化水体的研究奠定了基础。

附图说明

图1为头孢霉素Cef对小对叶愈伤组织诱导的影响。

图2为卡那霉素对小对叶离体叶片绿芽分化的影响。

图3为潮霉素对小对叶离体叶片绿芽分化的影响。