[发明专利]一种艰难梭菌A、B毒素胶体金检测试纸条、其制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种艰难梭菌A、B毒素胶体金检测试纸条、其制备方法及其应用。 

背景技术

艰难梭菌(Clostridium difficile)属厌氧性细菌，是梭菌属的一个成员。梭菌属可分为几个群，其中几个对人具有致病性的，最著名的有产气荚膜梭菌、破伤风梭菌和肉毒梭菌。艰难梭菌是造成抗生素相关腹泻及伪膜性结肠炎的病原菌。 

艰难梭菌芽孢菌的细菌平时寄生在人类肠道中。如果过量服用抗生素致使菌群增长速度过快，就会引发严重的炎症。该菌能引起伪膜性肠炎，90～95％的伪膜性肠炎患者粪便中能检出本菌。涂片染色可见粗大革兰氏阳性杆菌，位于菌体近端至颈端可见呈卵圆形芽胞，可结合临床作出早期诊断。艰难梭菌的一种流行菌株产生高水平的A、B毒素，毒素A有肠毒性，毒素B有细胞毒性。毒素A也有一定的细胞毒性作用，但比毒素B小。毒素A和B是艰难梭菌的主要致病因子，可干扰肠道上皮细胞的肌动蛋白骨架，使细胞丧失功能。目前实验室检验可帮助诊断艰难梭菌相关性腹泻(CDAD)。 

由艰难梭菌引发的医院内感染日益被人们重视，艰难梭菌产毒株的快速诊断、鉴定对确定病源、防止及控制医院内感染的传播和有效治疗极其重要。组织培养的方法检测艰难梭菌的产毒株，需要特殊的组织培养条件，操作繁琐复杂，且检测周期长，用于院内感染的监控难以普及。采用免疫学方法检测艰难梭菌毒素A&B则逐渐得以应用。 

艰难梭菌感染的临床表现轻重不一，且无特异性，诊断主要依赖于辅助检查，方法很多，各自的敏感性和特异性相差较大。艰难梭菌的分离培养一般用环丝氨酸-甲氧头孢噻嗪-果糖-琼脂(CCFA)选择培养基，其敏感性和特异性分别为97％和93％；细胞培养法测定细胞毒素的敏感性和特异性分别为67％和99％。免疫学测定毒素的方法(如放免、乳凝、ELISA等)敏感性和特异性在68％和95％左右。前两种方法费时，耗物，但准确可靠，后者简便快速可用于筛选。近年有文献报道用基因探针方法检测艰难梭菌感染，其敏感性和特异性有待进一步评价。此外，对于重症病人及时行纤维肠镜检查，常可发现特异性的伪膜，具有确诊意义。 

但通常认为艰难梭菌诊断以毒素检测和培养细胞的毒素中和试验为“金标准”。产毒素培养是检测艰难梭菌分离菌株的毒素产生情况，并具有较高的敏感性和相当的特异性。通常肠毒素的检测采用琼脂双扩散法、ELISA法、家兔肠管结扎试验、反向间接血球凝集试验、小鼠致死试验、豚鼠皮肤试验等，而直接粪便标本毒素验中和实验，在已确诊的CDAD患者中，会有15～38％检测不到毒素。但以上方法均存在需专业人员在特定的实验室，需要一定的设备和仪器，操作繁琐，时间长等缺点。 

胶体金免疫层析法(Immunochromatography Assay)始于上世纪90年代中期，是在免疫渗滤法的基础上发展起来的。它是免疫亲和技术、印迹技术、免疫标记技术和层析技术的组合。将包被抗原、胶体金标记抗体固相化，与样本吸附材料等组合在一起，制备为免疫层析诊断试条/板，使用时只需要把试纸条下插入样本溶液，数分钟就可以判断结果。与免疫渗滤法比较，稳定性好，操作更简便、快速，且由于为试条/试板形式，无需低温保存，储运方便。 

发明内容

本发明的目的是提供一种使用方便、快捷，用于检测艰难梭菌A、 B毒素的试纸条，检测人类粪便中艰难梭菌A、B毒素，用于艰难梭菌感染的辅助诊断。 

本发明的另一目的是提供一种艰难梭菌A、B毒素胶体金检测试纸条的制备方法。 

本发明的再一目的是提供一种艰难梭菌A、B毒素胶体金检测试纸条的应用。 

本发明提供了一种艰难梭菌A、B毒素胶体金检测试纸条，其包含：同时包被艰难梭菌A毒素的单克隆抗体或多克隆抗体、抗艰难梭菌B毒素的单克隆抗体或多克隆抗体和二抗IgG三个条带的硝酸纤维膜；及含有胶体金标记的艰难梭菌A、B毒素的单克隆抗体的玻璃纤维膜。 

其中，所述艰难梭菌A毒素的单克隆抗体的位点特异性的针对A毒素羧基端320个氨基酸的功能区。 

所述艰难梭菌B毒素单克隆抗体的位点特异性的针对B毒素羧基端的615个氨基酸的抗原区CDB3。 

艰难梭菌A、B毒素的单克隆抗体或抗艰难梭菌A、B毒素特异性抗原的多克隆抗体是用原核表达的基因工程抗原免疫Bab/c纯系小鼠制备获得。 

所述的二抗IgG为抗鼠IgG抗体。