[发明专利]一种检测巯基嘌呤甲基转移酶基因型的试剂盒、方法和用途

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种巯基嘌呤甲基转移酶基因型检测试剂盒、方法和用途。更具体的，本发明涉及通过聚合酶链式反应方法，提供一种分析编码巯基嘌呤甲基转移酶的基因位点多态性的试剂盒、方法和用途。

背景技术

嘌呤类药物，包括6-巯基嘌呤(6-MP)，6-巯代鸟嘌呤(6-TG)和巯唑嘌呤(AZA)是临床常用的肿瘤化疗药物，它们通过干扰体内的核酸代谢，包括核酸的从头合成和补救合成途径发挥作用。嘌呤类药物是无内在生物活性的药物，必须通过体内一系列代谢后才能发挥抗白血病效应。

研究表明，嘌呤类药物的疗效和巯基嘌呤甲基转移酶(thiopurine methyltransferase，TPMT)活性密切相关，临床研究表明，6-MP，6-TG以及AZA的临床疗效及不良反应和TPMT活性相关。TPMT活性高的个体，用药后生成活性代谢产物-巯基鸟嘌呤磷酸盐(TGNs)的浓度低，因此疾病的复发率高；而对于TPMT缺陷的个体，医用常规剂量的嘌呤类药物也会导致体内巯基鸟嘌呤磷酸盐的积累，产生严重的毒副作用如严重骨髓抑制和肝损害等，最终导致治疗的被迫中断，造成治疗的失败(Coulthard SA，Howell C，Robson J，et al.Blood，1998，92：2856-2862；Relling M V，Hancock ML，Boyett JM，et al.Blood，1999，93：2817-2823)。

人类TPMT基因总长为3.4kb，编码序列总长2.7kb，开放阅读框架含735个碱基。编码的TPMT的分子量大约为30000。由245个氨基酸残基组成。经研究发现，TPMT基因有3个重要的位点，分别是核苷酸序列中第238位点、第460位点和第719位点。当三个位点发生突变，即第238位的鸟嘌呤(G)→胞嘧啶(C)，结果使得氨基酸序列第80位的Ala(丙氨酸)→Pro(脯氨酸)，第460位的鸟嘌呤(G)→腺嘌呤(A)，使得氨基酸序列第154位的Ala(丙氨酸)→Thr(苏氨酸)，第719位的腺嘌呤(A)→鸟嘌呤(G)，使第240位的Tyr(酪氨酸)→Cys(半胱氨酸)。突变诱导的TPMT酶活性的减低或丧失，导致在使用嘌呤类药物时形成高浓度的TGNs，引起明显的造血组织细胞毒性，产生严重后果，甚至引起死亡(Tai HL，Krynetski EY，Yates CR，et al.Am J Hum Genet，1996，58：694-702；KrynetskiEY，Schuetz JD，Galpin AJ，et al.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92：949)。

研究发现，TPMT的基因型和其酶活性之间有很强的相关性，根据TPMT基因多态性和酶活性的关系，可以通过检测患者TPMT的基因型，推测患者体内TPMT酶活性的高低，预测不同患者对于嘌呤类药物的疗效和副作用，为医生提供用药时的参考。

根据国内外的文献报道，检测TPMT基因多态性的方法主要有荧光定量PCR方法、等位基因特异性PCR(allele specific PCR)、PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、变性高效液相色谱分析(DHPLC)、SNaP shot定点序列分析检测以及基因序列测定等分析方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种稳定可靠的高通量的检测巯基嘌呤甲基转移酶基因型的试剂盒及方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

应用巯基嘌呤甲基转移酶基因多态性位点的特异性引物和探针对样本DNA进行聚合酶链式反应，同时进行荧光标记探针荧光信号的扫描判定基因型的一种检测巯基嘌呤甲基转移酶基因型的试剂盒，该试剂盒包含检测巯基嘌呤甲基转移酶G460A和A719G多态性位点的基因特异性引物和探针。

其中，检测巯基嘌呤甲基转移酶  G460A多态性位点的正向引物为：5’-GGACGCTGCTCATCTTCTTAAAG-3’；反向引物为：5’-CCATTTGCGATCACCTGGAT-3’。检测巯基嘌呤甲基转移酶A719G多态性位点的正向引物为：5’-CCTCAAAAACATGTCAGTGTGATTT-3’；反向引物为：5’-CCTGATGTCATTCTTCATAGTATTTTAACA-3’。