[发明专利]一种在大肠杆菌中分泌表达重组人粒细胞集落因子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种大肠杆菌周质腔分泌型表达重组人粒细胞集落因子(G-CSF)方法，更具体地，涉及一种通过在G-CSF的N端添加DsbA信号肽(MKKIWLALAGLVLAFSASA(SEQID NO：1))，并使外源蛋白在大肠杆菌周质腔中表达的新型表达载体；这种表达载体的说明及应用。

技术背景

基因工程重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)，主要用于癌症患者化疗后的粒细胞减少症.此外还用于自身骨髓移植、某些类型的白血病、艾滋病的白细胞减少和再生障碍性贫血等，均显示具有显著的疗效。目前大多通过大肠杆菌表达，表达量虽高，但形成包涵体，需经过变性复性才能得到活性蛋白，收率很低，N端甲硫氨酸不能去除。

采用原核表达体系(主要是大肠杆菌表达体系)具有许多独特的优点。比如遗传背景清楚、细胞生长迅速、发酵周期短、易于筛选和基因重组操作、表达系统较为丰富等。但是原核表达体系也存在一些缺点：如外源蛋白无法糖基化和易于形成包涵体等。外源蛋白形成的包涵体必须经过变性、再折叠复性，才能得到活性蛋白产物。上述过程操作烦琐、复性效率低，对于不同的外源蛋白需要分别进行优化。因此，如果能够采用原核表达体系实现外源蛋白的胞内可溶表达或周质腔分泌表达，那么在实践应用中将会大大提高工作效率，节约生产成本。

人们采取过了多种方式促进外源蛋白的可溶表达。与谷胱甘肽(GST)或硫氧环蛋白融合表达，对部分外源蛋白能够起到促可溶作用；利用蛋白质二硫键形成相关蛋白、脯氨酰顺反异构酶和其他分子伴侣的辅助折叠作用，设计表达载体，能够明显促进外源蛋白的胞内可溶表达。但是，胞内可溶表达方式也具有比较明显的缺点：胞内属还原性环境，不利于外源蛋白形成正确的二硫键桥，进而影响正确构像的形成，而且需要超声破碎或压力破碎细胞壁才能释放胞内可溶表达组分，不利于大规模培养和纯化。比较而言，因为周质腔属氧化型环境，有利于形成正确的二硫键桥，而且提取周质腔表达组分时不需要破碎细胞壁，能够大幅度降低纯化成本，所以周质腔分泌型表达是一种理想的表达方式。通常将外源蛋白与适当的信号肽融合，借助信号肽的引导作用将外源蛋白分泌到周质腔中。控制表达载体的拷贝数，选择合适的启动子和培养基，采用适当诱导表达方式和培养条件(培养温度、诱导时机和诱导时间)，会改善周质腔分泌型表达的效率。

实验证明，连接到信号肽后的G-CSF，不仅实现周质腔分泌型表达，表达的G-CSF无须复性得到有活性的产物，经测序蛋白结构正确，N-端无多余氨基酸。分泌表达的原理是：将目的G-CSF编码序列融合到信号肽编码序列之后，表达产物在通过大肠杆菌细胞内膜分泌至胞周质(periPlasmic space)时，信号肽可被信号肽酶正确识别并切除。分泌后的外源蛋白不含N端甲硫氨酸，并已经空间折叠(包括形成二硫键)成具有天然构象的活性蛋白，无需后续的复性过程，从而简化了生产工艺.另外，蓄积在胞周质的外源蛋白避免了细胞内一些蛋白酶的降解，因而更加稳定。

发明内容

本发明的目的就是提供一种原核分泌表达G-CSF的方法，该方法的通用性好、表达量高、分泌效率高，适用于高效稳定地分泌表达多种外源基因，如G-CSF、IL-2等。

本发明涉及重组DNA技术，更具体地涉及一种新的原核分泌表达G-CSF质粒的构建方法。本发明还涉及原核分泌表达G-CSF的表达及提取方法。

附图说明

图1pDsbA-GCSF的结构图。

图2pBV-DsbA-GCSF的结构图。

图3周间腔蛋白电泳

在表达GCSF时，将基因被插入DsbA序列的下游，这使得表达基因时，所表达肽链由DsbA信号肽引导到周质腔中折叠形成活性蛋白。在本方法中选用了rrnB强终止序列，而且还有稳定作用。至于复制起点ori和标记基因(如抗性基因)等元件，没有任何特别限制。比如，用于筛选的抗性基因可选用四环素抗性基因、新霉素抗性基因、或氨节青霉素抗性基因等。

在本发明的另一个方面，提供了一种含有通用的周质腔分泌型表达载体pDsbA的宿主细胞，常用的为大肠杆菌DH5α，最佳地为大肠杆菌菌株W3110。

本发明所提供的载体具有以下特点：

1.共表达促折叠信号肽DsbA，有效促进GCSF在周质腔中的正确折叠，提高活性蛋白表达水平；

2.采用该载体进行周质腔分泌型表达时，不需要破碎细菌细胞壁，直接提取周质腔组分即可以收获目的蛋白。