[发明专利]一种人羊膜组织来源间充质细胞提取及传代培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及再生医学工程领域，特别是人羊膜间充质细胞(Human amniotic mesenchymal cells，hAMCs)作为细胞移植和组织工程组织构建的细胞来源，为组织修复和组织再造提供 新途径。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)作为一种多潜能细胞，由于其在体内所 定居的组织不同，微环境中的细胞因子、生长因子等各种调控物质不同，可促进MSCs向不 同的谱系分化。体外培养时，在不同的诱导条件下MSCs能够向不同的组织分化，不仅可分 化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和肌肉细胞等，而且还可以跨胚层分化，如可以分化为 外胚层的神经元、神经胶质细胞及内胚层的肝细胞等。

人羊膜间充质细胞(Human amniotic mesenchymal cells，hAMCs)是间充质细胞的一类， Gianandrea等(Gianandrea Pasquinelli，Pierluigi Tazzari，Francesca Ricci，et al。Ultrastructural Characteristics of Human Mesenchymal Stromal(Stem)Cells Derived from Bone Marrow and Term Placenta。Ultrastructural Pathology，2007，31：23-31)通过应用透射电镜对hAMCs的超 微结构进行研究，发现hAMCs表现为具有上皮和间质特征的超微结构，上皮样特征包括非 肠腔型表面微绒毛、细胞间连接，间质特征包括：rEF轮廓、脂滴等，这些特点从结构上阐 述了其具有多项分化潜能。

Sakuragawa等(Sakuragawa N，Kakinuma K，Kikuchi A，Okano H，Uchida S，Kamo I，et al. Human amnion mesenchyme cells express phenotypes of neuroglial progenitor cells.J Neurosci Res.2004；78：208-214.Erratum in：J Neurosci Res，2005；79：72)发现未分化hAMCs表达神经前 体细胞表型，87.7％的表达巢蛋白，93.1％表达musashi 1，用神经细胞诱导剂后出现双极或多 极突起，巢蛋白和musashi 1表达程度增加。hAMCs还可以被抗-Tuj 1、抗-NF-M和抗-GFAP 染色，并且诱导后阳性染色细胞数将明显增加，Tuj 1、NF-M和GFAP均是神经细胞的特异 性标志，这些结果表明在合适的培养条件下，hAMCs可以分化为神经细胞。

有人(Zhao P，Ise H，Hongo M，Ota M，Konishi I，Nikaido T.Human amniotic mesenchymal cells have some characteristics of cardiomyocytes.Transplantation.2005，79：528-535)把hAMCs 与新生鼠心脏分离块共同培养并植入发生心肌梗死的鼠心脏，hAMCs表达心脏特异性转录因 子GATA4、心脏特异性基因、L-型心脏特异性钙通道α单位(α1c)和一过性外向性钾离子 通道(Kv4.3)，同时发现经b-FGF诱导后，hAMCs表达心肌特异性转录因子Nkx2.5、心脏 特异性标志心钠素，经activinA诱导后表达心脏特异性基因α肌球蛋白重链(α-MHC)。hAMCs 在心肌梗死的瘢痕组织中能存活至少2个月，能与心肌组织整合并分化成为心肌样细胞。

Tomoharu(Tomoharu TAMAGAWA，Satoshi OI，Isamu ISHIWATA，et al。Differentiation of mesenchymal cells derived from human amniotic membranes into hepatocyte-like cells in vitro。 Human Cell，2007；20：77-84)发现hAMCs在诱导分化之后表达葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)、 鸟氨酸氨氨甲酰基转移酶(OTC)和肝细胞核移植4α(HNF-4α)的mRNA，并且具有储存糖原 的功能，而该功能是肝细胞的特异性功能之一，说明hAMCs可以分化成为肝细胞样细胞。