[发明专利]检测牛羊感染细菌的基因芯片、制备及检测方法、试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及检测牛羊感染细菌病原体的基因芯片、芯片的制备方法、检测方法和检测用试剂盒。

背景技术

牛布氏病、绵羊布氏病、山羊布氏病、牛结核病、人结核病是世界各国动物检疫部门重点防范的动物传染病及人畜共患病，我国质量监督检验检疫局也将其列为牛羊属动物出入境检验检疫的必检疫病。随着大型动物及相关制品的国际贸易日益频繁，相应的病原微生物检测技术应运而生。常规技术包括微生物培养技术、免疫技术、PCR技术等，尽管这些检测技术已发挥了巨大的作用，但仍存在如下缺陷：微生物培养技术繁琐而费时；免疫技术要有特异性强的抗血清；PCR技术本身的优越性无可厚非，但反应条件控制不当很容易引起交叉污染，出现假阳性。这些缺陷的存在使得常规的检测方法无法适应动物疫病检测快速、准确、高通量的要求，新的动物疫病检测方法的开发已迫在眉睫。

病原微生物基因组计划的突破性进展使得从基因水平检测病原微生物感染成为可能，近几年发展起来的生物芯片技术更是为病原微生物的基因检测提供了强有力的手段。生物芯片技术是具有微型化、高通量、并行处理及易于自动化等优势的前沿生物技术，它将大量的靶基因片段高密度、有序地排列在玻片、硅片等载体上，用相应的检测手段检测后，通过计算机软件进行数据比较和分析，一次试验就可对上万种基因进行快速、准确、高效的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测牛羊感染细菌病原体的基因芯片，以弥补传统的检测方法技术存在的不足。

本发明的另一个目的是提供检测牛羊感染细菌病原体的基因芯片的制备方法。

本发明的更进一步的目的是提供一种利用上述基因芯片来快速、准确、灵敏地检测牛羊感染细菌病原体的方法。

本发明还有一个目的是提供用于检测牛羊感染细菌病原体的试剂盒。

为达到上述的目的，本发明的技术方案如下：本发明的检测牛羊感染细菌病原体的基因芯片，包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，其中寡聚核苷酸探针包括检测探针和质量控制探针，芯片样品点的布局为低密度布局，样品点少于200个；所述的寡聚核苷酸检测探针是从牛布鲁氏杆菌、山羊布鲁氏杆菌、绵羊布鲁氏杆菌、牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌中的至少一种细菌基因组对应的核苷酸序列中选取的DNA片段。

其中一个优选的技术方案是所述的寡聚核苷酸检测探针包括从牛布鲁氏杆菌、山羊布鲁氏杆菌、绵羊布鲁氏杆菌、牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌基因组对应的核苷酸序列中选取的DNA片段。

本发明技术方案中所述的检测探针分别具有以下序列：从牛布鲁氏杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中SEQ ID NO：6所示的碱基序列；从山羊布鲁氏杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中SEQ ID NO：7所示的碱基序列；从绵羊布鲁氏杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中的SEQ ID NO：8所示的碱基序列；从牛结核分枝杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中SEQ ID NO：9所示的碱基序列；从人结核分枝杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如序列表中SEQ ID NO：10所示的碱基序列。

本发明制备检测牛羊传染病细菌的基因芯片的方法，包括以下的步骤：

(1)探针的设计：经Genbank检索，BLAST序列比对分别得到牛布鲁氏杆菌、山羊布鲁氏杆菌、绵羊布鲁氏杆菌、牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌基因组对应的核苷酸序列中的相对保守区，作为靶序列，依据探针设计原则，采用Primer Premier5.0和Oligo6.0软件，在此保守区内分别设计针对病原体的特异性的检测探针；

(2)检测探针的合成：由专门的生物公司合成上述设计好的探针片段序列；

(3)芯片的制备：包括切膜、贴膜，然后将上述得到的检测探针点膜，紫外交联10分钟，再经存膜即得芯片。其中点膜后得样品点直径在200μm-1000μm。