[发明专利]检测硝基咪唑类药物的方法及其专用酶联免疫试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检测硝基咪唑类药物的方法及其专用酶联免疫试剂盒。

背景技术

硝基咪唑类药物有甲硝唑、甲硝磺唑、氯甲硝哒唑、洛硝哒唑和二甲硝咪唑等， 其化学结构通式如图1所示(图中，当R1和R2均为甲基时，药物为二甲硝咪唑，当 R1为H，R2为乙醇基时，药物为甲硝唑)。本类药物常被用于预防和治疗特定病菌 和原生动物疾病，其原理是本类药物抑制原虫氧化还原反应，使病原体氮链断裂， 在体外有明显的杀灭阿米巴原虫和抗厌氧菌作用，对各部位的阿米巴均有效，口服 后迅速吸收，广泛分布于体内各器官和大多数体液中。但因其具有潜在的致癌性、 诱导有机体突变性，欧盟和我国已禁止在任何食品动物中使用该类药物。

目前测定硝基咪唑类药物方法主要有高效液相色谱法、液相色谱串联质谱等 等，其操作繁琐复杂且费用高，推广应用受到限制。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测硝基咪唑类的酶联免疫试剂盒。

本发明所提供的检测硝基咪唑类的酶联免疫试剂盒，包括硝基咪唑类特异性抗 体及包被原和酶标记物；所述包被原为硝基咪唑类半抗原与载体蛋白的偶联物或抗 抗体；所述酶标记物为酶标抗抗体或酶标硝基咪唑类半抗原；当所述包被原为硝基 咪唑类半抗原与载体蛋白的偶联物时，所述酶标记物为酶标抗抗体；当所述包被原 为抗抗体时，所述酶标记物为酶标硝基咪唑类半抗原；所述硝基咪唑类为下述四种 中的至少一种：甲硝唑、替硝唑、二甲硝咪唑和洛硝哒唑。

为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括硝基咪唑标准溶液、 显色液、浓缩洗涤液、终止液、浓缩复溶液；所述硝基咪唑标准溶液为甲硝唑标准 溶液。

所述浓缩洗涤液可以为含有0.8％-1.3％(质量百分含量)吐温-20和0.03-0.07％ (质量百分含量)叠氮化钠、pH值为7.0-7.4、0.02-0.05M的磷酸盐缓冲液；所 述浓缩复溶液可以为pH值为7.0-7.4、0.1-0.3M的磷酸盐缓冲液；当标记酶为辣 根过氧化物酶时，所述显色液由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液可以为 过氧化氢或过氧化脲，显色液B液可以为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液可以为 1～2M硫酸或盐酸溶液；当标记酶为碱性磷酸酯酶时，显色液可以为硝基磷酸盐缓 冲液，终止液可以为1～2M氢氧化钠溶液；所述百分含量为质量百分含量。

所述硝基咪唑类半抗原为洛硝哒唑半抗原；所述洛硝哒唑半抗原是将如下所示 化合物①和戊二酸酐通过缩合反应得到的。

上述硝基咪唑类半抗原是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能 诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。本发明采 用碳化二亚胺法将前述半抗原与载体蛋白偶联，突出了硝基咪唑药物的共有特征结 构，同时也增加了该半抗原的免疫原性和特异性。其中，洛硝哒唑半抗原与载体蛋 白的结合比例过低或过高都对免疫不利，半抗原与载体蛋白(如血蓝蛋白)的结合 摩尔比为(8-10)∶1。

所述硝基咪唑类特异性抗体为洛硝哒唑单克隆抗体；所述单克隆抗体是由保藏 号为CGMCC No.2545的对硝基咪唑类药物的单克隆杂交瘤细胞株C-2-2分泌的抗 体；所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体。

所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，其中优选为辣根过 氧化物酶。

所述浓缩洗涤液具体可以为含有1.0％(质量百分含量)吐温-20和0.05％(质 量百分含量)叠氮化钠、pH值为7.4、0.05M的磷酸盐缓冲液；所述浓缩复溶液可 以为pH值为7.2、0.2M的磷酸盐缓冲液。

当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述显色液由显色液A液和显色液B液组成， 显色液A液可以为过氧化氢或过氧化脲，显色液B液可以为邻苯二胺或四甲基联苯 胺，终止液可以为1-2M硫酸或盐酸溶液；当标记酶为碱性磷酸酯酶时，显色液可 以为硝基磷酸盐缓冲液，终止液可以为1-2M氢氧化钠溶液；所述百分含量为质量 百分含量。

在洗涤液中加入一定量吐温-20和叠氮化钠的作用在于：缓冲液中吐温-20会减 少抗体的非特异性吸附，还能对蛋白起到一定的保护作用，加入叠氮化钠后，则叠 氮钠在溶液中抑制细菌的生长，对溶液的稳定性其到一个保护作用。

本发明的另一个目的是提供一种检测硝基咪唑类药物的方法。

本发明所提供的检测硝基咪唑类药物的方法，包括以下步骤：