[发明专利]组织工程皮肤构建方法及用其制备的组织工程皮肤

权利要求书

1.一种组织工程皮肤构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)配制组织工程皮肤培养液：以商用无血清表皮细胞培养液为基础液，再按每500mL基 础液标准添加胰岛素20～50ng，氢化可的松100～300μg，维生素C 20～40mg，氯化钙1～2mM；

(2)制备人体成纤维细胞饲养层：将人体来源的成纤维细胞经抑制增殖处理后，以常规细胞 培养液添加体积比2～20％血清培养；所述抑制增殖处理为用5～100Gy γ或χ射线照射处理 0.5～20h或利用丝裂霉素C或博莱霉素处理0.5～20h；

(3)制备凝胶生物材料：将I型胶原蛋白、壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素按照8～12∶1～3∶ 1～2∶1～2质量份配比混合均匀，然后以1M氢氧化钠溶液调节PH至7.2～7.4；

(4)构建和培养组织工程皮肤：将所述步骤(2)制备的1～10×10⁵个成纤维细胞与1～3mL 所述步骤(3)制备的凝胶生物材料充分混合，得复合物，所述复合物在37℃，5％CO₂培养 箱中培养2h，然后在上面添加1～10×10⁵/mL人源表皮细胞悬液1mL，继续培养1h后，添加 由所述步骤(1)配制的组织工程皮肤培养液3～5mL，继续培养至第5天，将所得的组织工 程皮肤进行气液面培养，第20天结束培养，获得含有完好分化和成熟的表皮结构的组织工程 皮肤。

2.根据权利要求1所述的组织工程皮肤构建方法，其特征在于：所述步骤(1)中按每500mL 基础液标准添加胰岛素35ng，氢化可的松200μg，维生素C 30mg，氯化钙1.5mM。

3.根据权利要求1所述的组织工程皮肤构建方法，其特征在于：所述步骤(2)中以常规细 胞培养液添加体积比10％血清培养。

4.根据权利要求1所述的组织工程皮肤构建方法，其特征在于：所述步骤(3)中将I型胶 原蛋白、壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素按照10∶2∶1∶1质量份配比混合均匀。

5.利用权利要求1～4任一项所述的组织工程皮肤构建方法制备的组织工程皮肤。

6.权利要求5所述的组织工程皮肤在体外检测化合物毒性中的应用。