[发明专利]一种定量检测AML1/ETO mRNA水平的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种定量检测AML1/ETO mRNA水平的试剂盒。

背景技术

急性髓性白血病(AML)染色体异位t(8；21)(q22；q22)在分子水平上表现为AML1基因与ETO基因形成融合基因AML1/ETO，约有8-12％的成人及儿童原发性AML中含有该融合基因，约有40％的M2型AML患者含有该融合基因，此外M0型、M1型及M4型AML患者中亦有少数病例报道。AML1基因编码异二聚体转录因子CBF的α亚单位，它是造血系统发育的关键因子，ETO蛋白则是一个转录共抑制因子。目前关于AML1/ETO引发AML的机制还不十分清楚。AML1/ETO融合基因类型单一，AML1上的断裂点均在内含子5上，而ETO上的断裂点均在外显子2的上游，因此采用一套引物即可进行PCR扩增AML1/ETO融合基因。采用PCR技术检测AML1/ETO融合基因对于在AML的诊断、预后及治疗过程中微小残留病(MRD)的监测中具有重要的应用价值。

近几年发明的实时定量PCR技术(RQ-PCR)实现了PCR从定性到真正意义的定量的飞跃。与普通PCR相比，RQ-PCR除了能够定量之外还具有以下优点：(1)通过在PCR反应体系中加入探针或通过制作熔解曲线，使特异性增强、灵敏度提高；(2)扩增过程中闭管操作，实时收集数据，降低了污染机会，减少假阳性结果；(3)无需电泳，缩短了操作时间；(4)通过定量内参基因来评价样本质量，减少了假阴性结果。基于TaqMan探针的RQ-PCR技术关键之处在于：PCR反应体系中除了上、下游引物外还加入了TaqMan探针，该探针的5′端和3′端分别标有荧光报告基团(如FAM或TET)和荧光淬灭基团(如TAMRA)。PCR反应前，探针完整，荧光报告基团发射的荧光信号被荧光淬灭基团淬灭；随着PCR反应的进行，Taq酶发挥5’→3’的外切活性，使切下来的荧光报告基团远离荧光淬灭基团，产生荧光信号，荧光信号的强度与初始模板DNA的量成正比，当荧光信号强度大于阈值(基线以上10个SD)时，即可被荧光探测器定期实时监测，每个样本的CT值(PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环数)与起始模板量的对数值成正比，可以根据CT值利用标准曲线分别计算出目的基因及内参基因的量，二者相除的比值即为目的基因的相对水平。

要计算出起始模板的量必须利用标准曲线，标准曲线的制作是采用经过系列稀释的已知起始量的标准品进行RQ-PCR，标准品可以是已知质量的cDNA或已知拷贝数的质粒，前者制作比较简单，但是得到的未知样品结果不直观，较难理解；而质粒标准品尽管制备比较繁琐，但是利用它可以计算出未知样品的拷贝数，且结果直观，是目前应用最广泛的标准品类型。

内参基因选择的目的是为了消除不同样本之间mRNA质量、数量以及逆转录效率等方面的差异，内参基因的选择有以下三大要求：(1)在所有有核细胞中均稳定表达，与分化系列及分化阶段无关，不受实验处理的影响；(2)不存在假基因；(3)表达水平及降解水平与目的基因一致。

采用RQ-PCR技术检测AML1/ETO mRNA水平的临床应用价值主要体现在以下三大方面：(1)诊断：AML1/ETO mRNA为AML、尤其是M2型AML患者所特有，而急性淋巴细胞白血病(ALL)患者不表达该融合基因，因此采用RQ-PCR技术检测AML1/ETO mRNA水平有利于AML的确诊，并寻找出适合MRD监测的敏感特异的分子指标。最新的WHO诊断标准中已将AML1/ETO(+)AML单列为一种独立类型。(2)预后：AML1/ETO(+)患者的预后良好，因此采用RQ-PCR技术检测AML1/ETO mRNA水平可以将患者分层，有助于临床治疗方案的选择。(3)MRD的监测：目前对AML1/ETO(+)AML患者的治疗包括化疗及造血干细胞移植两大类，它们可以使大部分患者获得遗传学完全缓解，其后MRD的监测只能依靠目前公认的最敏感的RQ-PCR技术。MRD水平的确定是疗效评价、治疗方案的选择(如改变化疗方案、针对移植患者的供者淋巴细胞输注等临床干预措施)的重要依据，对于预防临床复发、提高患者缓解率、治愈率及生存率具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种定量检测AML1/ETO mRNA水平的试剂盒。

本发明所提供的定量检测AML1/ETO mRNA水平的试剂盒包括用于制作标准曲线的标准品、内参基因实时定量PCR体系和AML1/ETO实时定量PCR体系；