[发明专利]一种定量检测ABL mRNA水平的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种定量检测ABL mRNA水平的试剂盒。

背景技术

近几年发明的实时定量PCR技术(RQ-PCR)实现了PCR从定性到真正意义的定量的飞跃。与普通PCR相比，RQ-PCR除了能够定量之外还具有以下优点：(1)通过在PCR反应体系中加入探针或通过制作熔解曲线，使特异性增强、灵敏度提高；(2)扩增过程中闭管操作，实时收集数据，降低了污染机会，减少假阳性结果；(3)无需电泳，缩短了操作时间；(4)通过定量内参基因来评价样本质量，减少了假阴性结果。基于TaqMan探针的RQ-PCR技术关键之处在于：PCR反应体系中除了上、下游引物外还加入了TaqMan探针，该探针的5′端和3′端分别标有荧光报告基团(如FAM或TET)和荧光淬灭基团(如TAMRA)。PCR反应前，探针完整，荧光报告基团发射的荧光信号被荧光淬灭基团淬灭；随着PCR反应的进行，Taq酶发挥5’→3’的外切活性，使切下来的荧光报告基团远离荧光淬灭基团，产生荧光信号，荧光信号的强度与初始模板DNA的量成正比，当荧光信号强度大于阈值(基线以上10个SD)时，即可被荧光探测器定期实时监测，每个样本的CT值(PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环数)与起始模板量的对数值成正比，可以根据CT值利用标准曲线分别计算出目的基因及内参基因的量，二者相除的比值即为目的基因的相对水平。

要计算出起始模板的量必须利用标准曲线，标准曲线的制作是采用经过系列稀释的已知起始量的标准品进行RQ-PCR，标准品可以是已知质量的cDNA或已知拷贝数的质粒，前者制作比较简单，但是得到的未知样品结果不直观，较难理解；而质粒标准品尽管制备比较繁琐，但是利用它可以计算出未知样品的拷贝数，且结果直观，是目前应用最广泛的标准品类型。

内参基因选择的目的是为了消除不同样本之间mRNA质量、数量以及逆转录效率等方面的差异，内参基因的选择有以下三大要求：(1)在所有有核细胞中均稳定表达，与分化系列及分化阶段无关，不受实验处理的影响；(2)不存在假基因；(3)表达水平及降解水平与目的基因一致。

因此，通过构建ABL质粒标准品并实现对内参基因的绝对定量，是实时定量PCR的前提和基础，有利于检测技术标准化和临床推广。

发明内容

本发明的目的是提供一种定量检测ABL mRNA水平的试剂盒。

本发明所提供的定量检测ABL mRNA水平的试剂盒包括用于制作标准曲线的标准品、内参基因实时定量PCR体系；

所述内参基因优选为ABL基因，以ABL基因作为内参基因时，所述内参基因实时定量PCR体系包括上游引物、下游引物和TaqMan探针，所述内参基因实时定量PCR体系的上游引物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示，TaqMan探针的核苷酸序列如序列表中序列3所示。

上述内参基因实时定量PCR体系中还包括荧光PCR的Master Mix。

本发明中，上述内参基因实时定量PCR体系中的TaqMan探针的3′端连接有荧光淬灭基团TAMRA，5′端连接有荧光报告基团FAM。

上述定量检测ABL mRNA水平的试剂盒中的标准品为含有ABL基因的质粒标准品，所述ABL基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

为了方便使用，上述定量检测BCR/ABL mRNA水平的试剂盒还包括阴性对照质粒。

本发明的定量检测ABL mRNA水平的试剂盒具有以下特点：

1、覆盖面广：可用于以ABL为内参基因的多种白血病融合基因的实时定量PCR检测中。

2、敏感度高：可重复敏感度为5个拷贝。

3、成本低：实验体系仅为10μl，各成分用量均减少一半以上，从而使成本明显降低。

4、实用性强：本试剂盒同时包括内参基因实时定量PCR体系及质粒标准品，可定量出未知样本的ABL拷贝数，有利于判断样本的RNA质量和检测敏感度。

5、使用简便：使用时只需加入待测样品的cDNA即可开始PCR反应。

6、储存期长：-20℃条件下可以长期保存(＞1.5年)，且不影响检测效果。

本发明的试剂盒可以准确、快速、定量测定ABL mRNA水平。在各种白血病融合基因检测中，可以ABL为内参基因，用本发明的试剂盒进行内参基因的定量，以实现各种白血病融合基因的准确、快速、定量，进而准确、快速地进行白血病的分子诊断和微小残留病的监测，为临床疾病确诊、治疗方案的确定、疗效评价及预后提供重要的分子依据。