[发明专利]A型流感病毒核蛋白捕获ELISA抗原诊断试剂盒及专用单克隆抗体

说明书

技术领域

本发明涉及A型流感病毒核蛋白捕获ELISA抗原诊断试剂盒及专用单克隆抗体。

背景技术

禽流感的频繁暴发，给养殖业带来了巨大的经济损失；对流感病毒做出快速诊断或早期诊断以及进行禽流感在养殖业禽类中的净化，是控制该病的重要环节。A型流感病毒亚型包括16个HA亚型和9个NA亚型，各亚型之间血凝素抗原差异较大，针对HA进行亚型抗原诊断有一定难度。而核蛋白(NP)蛋白在A型流感病毒各亚型之间变异程度很低，具有良好的保守性，可以作为A型特异性抗原对A型流感病毒进行诊断。

目前应用于AIV病原诊断的方法主要有病毒分离、血凝和血凝抑制试验、琼脂扩散试验和RT-PCR等。病毒分离和RT-PCR方法是目前最为常用的两种方法，但病毒分离法耗时较长，不易作为快速诊断；RT-PCR方法，虽然用时较短，但成本较高，不易作为大规模调查。血凝和血凝抑制试验，又需要在病毒分离的基础上，在基层又难以实现和推广，不宜用来进行大规模的样品检测。

发明内容

本发明的目的是提供A型流感病毒核蛋白捕获ELISA抗原诊断试剂盒及专用单克隆抗体。该试剂盒可用于对临床采集拭子或病毒尿囊液进行流感病毒核蛋白检测。

本发明所提供的抗A型禽流感病毒核蛋白单克隆抗体，是由对A型流感病毒NP蛋白杂交瘤细胞株C4(CGMCC No.2575)分泌产生的，对A型流感病毒NP蛋白杂交瘤细胞株C4已于2008年7月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.2575。

保藏号为CGMCC No.2575的对A型流感病毒NP蛋白杂交瘤细胞株C4也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种A型流感病毒核蛋白捕获ELISA抗原诊断试剂盒。

本发明所提供的A型流感病毒核蛋白捕获ELISA抗原诊断试剂盒，包括已包被所述的抗A型禽流感病毒核蛋白单克隆抗体的固体载体和酶标记的所述的抗A型禽流感病毒核蛋白单克隆抗体。所述酶具体可为辣根过氧化物酶。

其中，为了便于检测，所述试剂盒中还包括阴性和阳性对照。所述阳性对照为昆虫杆状病毒表达系统表达的重组禽流感病毒核蛋白或所述昆虫杆状病毒表达系统表达的重组禽流感病毒核蛋白溶液；所述阴性对照为未感染禽流感病毒的SPF鸡胚尿囊液或其稀释液。所述昆虫杆状病毒表达系统表达的重组禽流感病毒核蛋白溶液中，所述重组禽流感病毒核蛋白的浓度为15ug/ml；所述未感染禽流感病毒的SPF鸡胚尿囊液的稀释液是将所述鸡胚尿囊液稀释40倍得到的。

本发明的抗A型禽流感病毒核蛋白单克隆抗体效价和特异性高。本发明的A型流感病毒核蛋白捕获ELISA抗原诊断试剂盒，能敏感而特异地从临床采集的拭子和鸡胚繁殖的尿囊液中检测到A型流感病毒核蛋白抗原。操作简单，敏感性高，特异性强。可用于A型流感病毒临床检测和实验室检测，具有很高的应用价值。

具体实施方式

实施例1、对A型流感病毒NP蛋白杂交瘤细胞株C4 CGMCC No.2575分泌的单克隆抗体

1)制备抗A型禽流感病毒核蛋白单克隆抗体

a.动物免疫

将用甲醛灭活的H9N2亚型禽流感病毒注入到Balb/c小鼠体内，使其产生多克隆抗体血清。

b.细胞融合和克隆化

小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按7∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到能稳定分泌抗禽流感病毒核蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将该抗禽流感病毒核蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为对A型流感病毒NP蛋白杂交瘤细胞株C4，该细胞株已于2008年7月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.2575。

c.细胞冻存和复苏

将抗禽流感病毒核蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株用冻存液制成1×10⁹个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

d.单克隆抗体的生产与纯化