[发明专利]一种构建生产外源蛋白用的转基因用模型鸡的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种构建生产外源蛋白用的转基因用模型鸡的方法。

背景技术

上个世纪70年代DNA重组技术的建立，使异源DNA可以被引入到真核细胞中，这种基因转移技术为人类提供了从遗传上改变高等动物细胞的能力，并成为制备转基因动物和进行基因治疗的基础。应用DNA重组技术，目前人们已经成功地获得了包括小鼠、牛、猪、兔、鸡、鱼、线虫和海胆等多种转基因动物，1990年，转基因方法也被用于人类基因治疗的研究中。对于许多高等动物，特别是具有完善的免疫系统的脊椎动物而言，基因传递系统存在潜在的免疫刺激性，异源基因的表达容易引起宿主产生免疫应答。通常情况下，无论是制备转基因动物还是进行基因治疗，其目的就是为了高效的获得外源基因的表达产物。由于宿主本身并没有这些蛋白，自然将其识别为非自身抗原而加以清除，造成转基因蛋白的瞬时表达，甚至引发炎症反应。为了避免这种情况的发生，需要宿主对特定的外源蛋白产生免疫宽容，不发生免疫排斥反应，即形成免疫耐受。

免疫耐受是指免疫系统与机体固有成分或被引入的抗原不发生破坏性免疫反应的一种生理状态，这种状态可以通过将抗原引入发育中的免疫系统而人为诱导。根据抗体产生的克隆选择学说，正常情况下，胚胎与外部抗原刺激是隔离开的，胚胎的淋巴系统只会遇到自身抗原，从而导致了自身免疫反应的消除(免疫宽容)。免疫系统在发育过程中学会了耐受，它的任务是通过T细胞和B细胞抗原受体基因的重排产生随机的结构多样性，识别不期而遇的分子并作出反应，因而是一种获得性现象，需要抗原诱导才能产生，即便是对自身抗原的耐受也是如此。但是对于大多数转基因动物，特别是作为生物反应器的转基因动物，外源基因通常在免疫系统已发育完全的成年动物中表达，因此需要建立一种通过向发育早期的胚胎中引入外源抗原诱导免疫耐受的方法。

抗原性物质进入机体后能否诱导产生免疫耐受，主要取决与抗原和机体两方面的原因，一般而言，小分子可溶性、非聚合状态的抗原，如血清蛋白、多糖和脂多糖等多为耐受原。这些小分子可溶性抗原在体内不易被吞噬细胞摄取，有可能以最适浓度通过直接与淋巴细胞作用的方式诱导机体产生免疫耐受。而大分子颗粒性物质和蛋白质聚合物，如血细胞、细菌或人丙种球蛋白聚合物等为良好的免疫原。这些大分子物质易被吞噬细胞摄取，经加工处理后可有效刺激淋巴细胞产生免疫应答。诱导耐受所需的抗原剂量随抗原种类、耐受细胞类型、动物属种、品系和年龄而异。一般而言，抗原经静脉注射最易产生免疫耐受，腹腔注射次之，皮下和肌肉注射最难，但不同部位静脉注射引起的结果也不相同。例如人丙种球蛋白经肠系膜静脉注入可引起耐受，经颈静脉注入则引起免疫应答；IgG或白蛋白注入门静脉能引起耐受，注入周围静脉则引起免疫应答。诱导免疫耐受形成的难易还与机体免疫系统的发育程度有关，一般在胚胎期最容易，新生期次之，成年期最难。体外实验证实，未成熟免疫细胞易于诱导产生免疫耐受，成熟免疫细胞则难以诱导产生耐受；诱导成熟免疫细胞耐受所需的抗原量比诱导未成熟免疫细胞耐受所需的抗原量高数十倍。目前大量的实验证据表明，免疫耐受的形成与免疫系统初次接触抗原时所处的发育阶段密切相关，免疫耐受可以通过对胚胎或新生幼雏接种抗原而诱导。

与哺乳动物不同的是，禽类的胚胎发育是在离开母体的密闭蛋壳内独立完成的，这为胚胎期接种抗原提供了更为方便的条件。

发明内容

本发明的目的是提供一种构建生产外源蛋白用的转基因用模型鸡的方法。

本发明所提供的构建生产外源蛋白用的转基因用模型鸡的方法包括以下步骤：

1)将外源蛋白导入种蛋的卵黄囊内；

2)将上述步骤1)的种蛋静置孵育46-50小时后，再继续孵化至出雏，得到生产外源蛋白用的转基因用模型鸡。

上述方法中，所述种蛋的胚龄为5-7天。

所述外源蛋白为牛血清白蛋白、牛乳酪蛋白或人血清白蛋白，优选为牛血清白蛋白；所述牛血清白蛋白的浓度为0.8-1.2g/L，导入的剂量为每只种蛋80-120μl。

具体操作时，可在种蛋的气室上打两个孔，其中一个孔位置在于气室边缘下方0.3-0.5cm处，通过气室上的窗孔将外源蛋白导入卵黄囊中。

本发明在鸡胚胎发育早期，其免疫系统尚未完善之前，通过向种蛋的卵黄囊中导入外源蛋白，使其与卵黄营养物质一起被发育中的胚胎吸收，进入到胚胎的血液循环系统，随着血液循环经过胸腺时与正在发育的免疫细胞相互作用，诱导鸡胚免疫系统产生对外源蛋白的免疫沉默，最终获得对特定外源蛋白免疫耐受的转基因用模型鸡。