[发明专利]HIV毒株耐药表型分析细胞模型及其专用假型慢病毒

说明书

技术领域

本发明涉及HIV毒株耐药表型分析细胞模型及其专用假型慢病毒。

背景技术

人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)，又称艾滋病毒，由HIV感染而引起的疾病称为艾滋病，全称为获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmunodeficiency syndrome，AIDS)，该病患者的免疫功能部份或完全丧失，CD4+细胞数目减少，继而发生机会性感染、肿瘤等，临床表现多种多样。该病传播速度快、病死率高，且目前无法治愈，引起了各国政府和社会的关注。HIV的流行呈世界性分布，非洲为HIV的发源地和重灾区，欧洲和美洲也为主要流行区，近年HIV在亚洲的流行呈高速增长的趋势。我国自1985年首次发现HIV感染者，至今已有60～80万人发生了感染，专家估计，如果不迅速采取有效的预防措施，按目前的年平均30％的增长速度，到2010年，我国的HIV感染者将超过1000万。在非洲的有些国家，HIV的感染率达总人口30％以上。因此，预防和治疗艾滋病，已不仅仅是挽救个人生命的问题，而是关系到民族存亡的大事。

HIV在病毒分类学上属逆转录病毒科(Retroviridae)慢病毒属(lentivirus)，目前已发现两种HIV，分别为HIV-1和HIV-2。两者具有相似的病毒结构和传播途径。HIV-2主要分布于非洲西部，在欧洲和美洲的一些感染者中也被检测到，毒力和传播力都低于HIV-1，引起的艾滋病病程较慢且较缓和。HIV-1广泛分布于世界各地，是引起全世界AIDS流行的病原，目前HIV的研究也是以HIV-1为主进行的。

艾滋病病毒(HIV)颗粒呈球形，直径90nm～130nm。病毒的核心呈中空锥形，由两条相同的单链RNA链、逆转录酶和蛋白质组成。核心之外为病毒衣壳，呈20面体立体对称，含有核衣壳蛋白质。最外层为包膜，包膜上的糖蛋白有刺突状结构，是HIV与宿主细胞受体结合位点和主要的中和位点。HIV RNA中含有gag、env和pol基因以及6种调控基因〔tat，vif，vpr，vpx(vpu)，nef，rev〕。gag基因编码病毒的核心蛋白；pol基因编码病毒复制所需要的酶类(逆转录酶、整合酶和蛋白酶)；env基因所编码的病毒包膜蛋白，是HIV免疫学诊断的主要检测抗原。

HIV主要侵犯人体的CD4+T淋巴细胞和巨噬细胞，其感染过程包括病毒的吸附、侵入、逆转录、基因组的整合、表达及释放等过程。当感染发生时，病毒的外膜糖蛋 白gp120首先与细胞表面的CD4分子结合并与辅助受体CCR5或CXCR4等结合，gp120空间构象发生改变，暴露出跨膜蛋白gp41与细胞膜作用，导致病毒包膜与细胞膜融合，病毒核心进入细胞内，脱壳后病毒基因组在RT作用下以病毒RNA为模板合成cDNA，再以此cDNA为模板合成双链DNA，在病毒整合酶IN的作用下随机整合到细胞染色体上成为前病毒而长期存在并随细胞的分裂而传至子代细胞。该前病毒即为病毒复制时的转录模板，病毒进行复制时，早期转录的长链mRNA经剪接后表达病毒的调节蛋白，待调节蛋白的量到达一定阈值后，病毒进入晚期转录，产生的未拼接的mRNA部分用来指导合成病毒的结构蛋白，部分作为病毒的基因组，与结构蛋白进行装配成为病毒核心颗粒，由胞膜出芽时获得包膜及膜蛋白。

抗HIV药物的大量应用导致了耐药性问题出现，因此建立快速、高效、低成本的HIV毒株耐药分析技术为当前急需解决的关键问题。目前进行HIV毒株耐药分析的方法主要有两种：一种是测定毒株的核苷酸序列，与HIV耐药突变数据库进行比对，从而预测毒株是否产生耐药性，这种方法即基因型耐药分析方法，具有一定的指导意义，但是不够准确；另外一种是表型耐药分析方法，即通过耐药实验检测毒株对某种药物的抗性，该方法结果准确，但是操作复杂，周期长，往往需要分离病毒，并且HIV的分离培养并不是件容易的事情，成功率不太高。

发明内容

本发明的目的是提供HIV毒株耐药表型分析细胞模型及其专用假型慢病毒。

本发明提供了一种表达HIV的Gag基因(gag)的重组表达质粒。

所述表达HIV的Gag基因(gag)的重组表达质粒可为表达HIV的Gag基因同时缺失其蛋白酶-逆转录酶的重组表达质粒，具体可为图1所示的pGag。

本发明还提供了一种混合质粒，包括表达HIV的Gag基因的重组表达质粒和表达报告基因的重组慢病毒质粒。