[发明专利]新型中性植酸酶

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型中性植酸酶，特别涉及来编码该中性植酸酶的基因序列。

背景技术

植酸酶是一种可以将植酸水解为肌醇和磷酸的酶类。饲料中添加植酸酶后可将植酸和植酸盐水解成肌醇和磷酸盐，供动物吸收利用，从而提高磷的利用率和骨骼矿化程度，可节约磷资源、降低饲料成本。但天然来源的植酸酶含量太低而难以大量提取生产。

因此，找到一种新型的植酸酶，并通过基因工程手段克隆该植酸酶基因，然后在生物反应器中高效表达植酸酶基因，可以使植酸酶的制备产业化。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的植酸酶基因，将该基因克隆并表达后，可以得到一种新型的中性植酸酶，该酶可以产业化生产，并具有较高的比活力。

本发明提供了一种新的中性植酸酶基因：本发明筛选出含有胞外分泌植酸酶的柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)，并从该柠檬酸杆菌基因组中PCR得到一个中性植酸酶基因phyA；将该基因克隆到表达载体pPIC9K，转化到酵母菌GS115中。用甲醇诱导植酸酶的表达，通过镍柱亲和纯化带有His Tag的植酸酶。通过SDS-PAGE验证植酸酶纯化情况。

对上述植酸酶进行了性质的测定通过不同温度和不同pH值的处理，得到该酶的最适温度和最适pH值等性质。

经测定，本发明得到的新的植酸酶比活力约为1000U/mg。

本发明提供的新的中性植酸酶基因，具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO：1所编码的植酸酶蛋白具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其衍生序列。

所述氨基酸序列的衍生序列包括以下情况：

(f)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有植酸酶功能的多肽；

(g)将SEQ ID NO：1所示的核酸分子的简明序列所编码的多肽；

(h)在严谨条件下与SEQ ID NO：1所示核酸分子的互补链杂交的核酸所编码的具有植酸酶活性的多肽；

(i)由SEQ ID NO：1所示核酸分子的等位基因或天然变体所编码的具有植酸酶活性的多肽；或

(j)与SEQ ID NO：2所示的多肽序列具有至少70％同源性的具有植酸酶活性的多肽，优选75％，80％，85％，90％或95％，特别是99％的同源性。

通过基因工程手段，如人工合成或其它方式克隆该植酸酶基因，然后在生物反应器中高效表达，可以产业化生产具有较高酶活性的中性植酸酶。

附图说明

图1：中性植酸酶PHYA的最适pH结果。

图2：pPIC9K-phyA的质粒图谱

序列信息：

编码柠檬酸杆菌的中性植酸酶成熟蛋白质的DNA序列SEQ ID NO：1；

柠檬酸杆菌的中性植酸酶成熟蛋白质的氨基酸序列SEQ ID NO：2

具体实施方式

以下实施例中所用的材料和试剂来源如下：

1.菌株与载体  大肠杆菌菌株E.coli BL21(DE3)购自Novagen公司，载体由本研究构建并保存。巴斯德毕氏酵母GS115和表达载体pPIC9K购自invitrogen公司。

2.酶与试剂盒  限制性内切酶，连接酶，Taq酶为NEB公司产品。基因组提取试剂盒为天根生化公司产品。

3.生化试剂DNA合成试剂为Milipore公司产品。引物合成为ABI公司Cyclone DNA合成仪。IPTG、X-Gal、SDS及植酸酶钠为Sigma公司产品。TEMED、过硫酸铵、丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺为Promega公司产品。NTA树脂为Qiagen公司产品。

4.培养基  大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。巴斯德毕氏酵母养基为YPD(2％蛋白胨、1％酵母提取物、2％葡萄糖)。

实施例1产植酸酶的柠檬酸杆菌的筛选