[发明专利]一种Aurora B稳定表达细胞系及其在抗癌小分子药物筛选中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种Aurora B稳定表达细胞系及其在抗癌小分子药物筛选中的应用。

背景技术

癌症已经成为严重威胁人类生命和健康的一大杀手，据统计，全球每年有1000万人患上癌症，其中，有600万人死于癌症。在目前的癌症治疗方法中，针对癌细胞中过量表达的基因设计小分子药物是重要的可行性方法之一。Aurora B是关键的细胞周期调控激酶，在许多人类肿瘤细胞系中均过量表达，并且伴随着染色体不稳定的状况，因此Aurora B是设计治疗癌症的小分子药物的重要靶点之一。

人类Aurora B基因(全称为Aurora kinase B)是在筛选癌细胞中过量表达的激酶时发现的。它的编码基因位于基因组第17号染色体17p13上，其cDNA序列全长1032bp，蛋白分子量为39kD。Aurora B蛋白的C端是个保守的催化结构域，N端则差异相对较大，但仍含有A-box I、A-box II和A-box III三段保守序列(Fu J，BianM，Jiang Q，Zhang C(2007)Mol Cancer Res 5：1-10.)。Aurora B是染色体乘客蛋白(chromosome passenger protein)的核心组分，它在有丝分裂前期时与染色体结合；中期时集中在中心粒上；后期开始时，Aurora B从中心粒转移到赤道板上，分裂沟和收缩环就在这个位置形成(Adams et al.，2001.Curr Biol 2000；10：1075-8.)。AuroraB的定位说明其很有可能在有丝分裂前期与染色体活动有关，而在后期和末期与细胞骨架有关。许多研究发现，Aurora B在有丝分裂染色体凝集、姐妹染色单体分离和胞质分裂过程中起重要作用。Aurora B作为一个激酶，其磷酸化的底物主要有H3、CENP-A、INCENP和Survivin等。Aurora B蛋白的编码基因在NCBI中的GeneID是9212。

发明内容

本发明的目的是提供一种Aurora B稳定表达细胞系的制备方法。

本发明所提供的Aurora B稳定表达细胞系的制备方法，包括以下步骤：

1)将Aurora B的编码基因插入真核表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体；

2)将步骤1得到的重组表达载体导入宿主细胞中，筛选得到稳定表达Aurora B的细胞系。

上述真核表达载体具体可为pEGFP-C2、pCMV-Tag、pCMV-Myc等。

为了便于对表达的Aurora B进行细胞定位，可在真核表达载体上加入可在宿主中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因，如GFP、RFP。

上述宿主细胞可为HeLa细胞、293细胞、3T3细胞等。

利用上述方法制备的Aurora B稳定表达细胞系也属于本发明的保护范围。

将一株GFP-Aurora B稳定表达的HeLa细胞株于2008年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路3号)，保藏号为CGMCC No.2652。

本发明的Aurora B稳定表达细胞系具有以下优点：(1)可以直接在荧光显微镜下观察活体重组细胞中Aurora B的动态变化(in vivo)，这与传统的免疫荧光方法和用Western blot方法观察Aurora B的定位相比，更加快速，而且可以真实的反应Aurora B在细胞内的状况；(2)本发明的Aurora B稳定表达细胞系上带有GFP标签，并且Aurora B稳定、过量表达，因此可以方便的通过IP、Pull down等实验研究与Aurora B激酶相互作用的蛋白，这对于解析细胞周期进程中许多过程有重要意义，也为肿瘤的治疗提供了很好的理论依据；(3)本发明的Aurora B稳定表达细胞系可以加速抗癌小分子药物的筛选进程。GFP-Aurora B在荧光显微镜下可作为一个直观的动态指标反映出小分子药物对重组细胞的处理效果。

本发明的另一个目的是提供一种筛选抗癌小分子药物的细胞模型。

本发明所提供的筛选抗癌小分子药物的细胞模型是上述Aurora B稳定表达细胞系。