[发明专利]一种产抗菌活性成分的滇重楼内生镰孢菌

说明书

技术领域

本发明涉及一种产抗菌活性成分的滇重楼内生镰孢菌，属于微生物技术领域。

背景技术

植物内生真菌是指那些在其生活史中的某一阶段或全部阶段生活在健康植物组织或器官内部，宿主植物不表现出外在病害症状的真菌。植物内生真菌是一种新的微生物资源，能产生多种结构类型的代谢产物，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗虫、调节植物生长等多种生物活性。由于植物内生真菌能产生结构新颖、功能独特的代谢产物而成为新化合物、新药物的潜在资源，它们在农业、医药、食品等领域具有重要的应用前景。

一些内生真菌能产生抗菌活性成分，主要包括生物碱类、肽类、甾体类、萜类、酚类、醌类、脂肪族类、异香豆素类等多种结构类型，这些抗菌活性成分在内生真菌中具有重要的生理生态功能，同时有可能直接开发成杀菌剂，也可以作为研制新型杀菌剂的先导结构。因此，研究内生真菌的抗菌活性成分既具有理论意义，又具有重要的应用前景。

滇重楼(Paris polyphylla var.yunnanensis Hand.)在分类上属于单子叶百合目延龄草科(Trilliaceae)，为我国特有的药用植物，分布于云南、四川、贵州等省区，其根状茎多年生长在地下，对土传病原菌具有强的抵抗能力，这很可能与其共生的内生菌有关。

目前尚未见从滇重楼内生镰孢菌中分离抗菌活性成分的报道。本发明着重于滇重楼内生镰孢菌抗菌活性成分的研究，为探讨该内生真菌的生理生态功能(如：提高宿主的抗病性等)提供依据。

本发明的目的是提供一种经发酵培养能产生抗菌活性成分的微生物，即滇重楼内生镰孢菌。

发明内容

本发明涉及一种产抗菌活性成分的滇重楼内生镰孢菌(Fusarium sp.)，菌株代号为Ppf4，为一种微生物材料，现保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮政编码100101)；保藏日期为2008年4月29日，登记入册编号为CGMCC No.2473。本发明提供如下的技术方法。

1、内生镰孢菌Ppf4的分离

采集新鲜的滇重楼根状茎，采用内生真菌的分离和纯化技术，获得一株内生真菌，编号为Ppf4。

2、内生镰孢菌Ppf4的形态特征

(1)无性世代：内生真菌Ppf4在PDA培养基上25℃培养，菌落疏松，绒毛状，浅红色至暗红色，边缘白色，表面有明显的水滴，背部产生大量红色色素，分生孢子梗细长，分隔，分生孢子无色，单胞，聚集在粘液滴中，分生孢子卵圆形，长椭圆形，4.8-16.8μm×2.9-6.0μm。内生真菌Ppf4的形态特征(见图1、图2、图3和图4)符合镰孢菌属(Fusarium)真菌的形态特征。

(2)有性世代：未发现。

3、内生镰孢菌Ppf4的分子生物学特征

运用PCR技术，扩增采用ITS通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。将Ppf4菌株的ITS序列提交到GenBank核酸序列库中注册获得序列号(accession number)EF495241。同时将Ppf4菌株的ITS序列与GenBank中其他真菌的ITS序列进行比对，找出相似性最高，亲缘关系最近的真菌，Ppf4菌株的ITS序列与镰孢菌(Fusarium sp.)DQ780425的ITS序列相似度为99.0％，其同源性的系统发育树图见图5。

4、内生镰孢菌Ppf4的发酵培养特征

培养基：马铃薯-葡萄糖(PD)液体培养基。

培养温度：25±1℃。

发酵时间：7天。

摇床转速：120rpm。

发酵培养特征：培养第2天，菌液无色；培养第4天，菌液略带橙红色；培养第7天，菌液为深红色。

5、内生镰孢菌Ppf4粗提物的抗菌活性

采用琼脂打孔药剂扩散法，内生真菌Ppf4菌液和菌丝提取物均表现出一定的抗菌活性，菌液提取物的活性强于菌丝提取物。采用多孔板液体稀释法，噻唑蓝(MTT)为显色剂，测定了内生真菌Ppf4菌液和菌丝提取物的最低抑制浓度(MIC)，菌丝提取物对大肠杆菌、根癌土壤杆菌和溶血葡萄球菌的MIC值分别为：1.50mg/mL、1.50mg/mL和1.00mg/mL。菌液提取物对大肠杆菌、根癌土壤杆菌、黄瓜角斑病菌、溶血葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的MIC值分别为：0.25mg/mL、0.125mg/mL、1.50mg/mL、0.25mg/mL和1.50mg/mL。

6、抗菌化合物的追踪分离特征