[发明专利]一种昆虫源抗菌蛋白/肽基因的构建及筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及领域包括昆虫资源利用、生物技术和医药与兽药研制，可适合各种昆虫的 筛选。

背景技术

作为地球上种类最多的生物，昆虫具有繁殖快、适应性广的特点，除海洋外，所有生 态环境都有昆虫的分布。自19世纪起，昆虫就被作为免疫防卫系统的研究对象，研究表明 抗菌蛋白在昆虫体液免疫反应中起着关键作用(Boman，2003；Kimbrell，2001；Hoffmann 等，1992；Hultmark，1993)。尚存于地球上的现有昆虫都是经受剧烈的生存竞争获胜而 生存下来的，它们在长期进化的过程中增强了抵抗各种病原菌侵染的能力，这就为我们筛 选具有抗菌作用的昆虫抗菌蛋白/肽及其目的基因提供了丰富的基因资源库。抗菌蛋白/肽 因其独特的生物活性以及不同于传统抗生素的特殊作用机理，已引起人们极大的研究兴 趣。它抗菌谱广，对细菌、病毒、某些原虫、真菌及肿瘤细胞等具有选择性杀伤作用(Boman， 2000)且本身无毒、无害(Giacometti等，2000)。目前，从昆虫体内获得约有170种抗菌 肽(Bulet等，1999)。

自1980年瑞典斯德哥尔摩大学Boman研究小组，首次由大肠杆菌注射诱导处理的惜古 比天蚕蛾滞育蛹血淋巴中提纯得抗菌肽以来，国内外许多学者就昆虫源的抗菌蛋白/肽已做 了大量的筛选、活性测定、基因克隆与表达等工作，且明确昆虫抗菌蛋白/肽可分成天蚕素 (cecropins)、防卫素(defensins)、富含脯氨酸的抗菌肽(prolin-rich antibacterial peptides) 和富含甘氨酸的抗菌肽(glycine-rich antibacterial peptides)，计四大类(Brey等，1998)。 尽管如此，在筛选方法及相应的基因克隆技术方面还是存在效率偏低，新抗菌蛋白/肽及其 基因难以发现等问题。如图1所示，传统的研究中所采取的技术途径不外乎2种：

【途径1】(1)先用外源因子如常用注射大肠杆菌，诱导昆虫产生抗菌蛋白/肽；(2) 以抗生素(青霉素)为对照，用纸片法进行抑菌圈测定，以评价抗菌效果；(3)再分离 纯化虫体匀浆液或血淋巴中的抗菌蛋白/肽，作进一步活性验证；(4)测定纯抗菌蛋白/ 肽的N端氨基酸序列，设计兼并引物，采用PCR法扩增基因，再进行表达，及表达产物活 性的验证(Lehrer，R.I.，ROSENMAN，m.，Harwig，S.S.，Jackson，R.and Eisenhauer，P. Ultrasensiteve assays for endogenous antimicrobial polypiptides.J.Immuno1.Methods，1991，137： 167-173；Cole，A.M.，Wu，M.，Kim，Y.H.and Ganz，T.Microanalysis of antimicrobial proerties ofhuman fluids.J.Microbiol.Methods，2000，41：135-143；Barreteau，H.，Mandoukou，L.，Adt， I.，Gaillard，I.，Courtois，B.and Courtois，J.A rapid method for determing the antimicrobial activity ofnovel natrual molecules.J.Food Prot，2004，67：1961-1964)。

该研究途径的主要局限：一是需要对一个一个组分进行逐一分析，工作量大，效率低； 二是对蛋白/肽纯化技术及设备要求高，正因为这样，有时即使发现了有很强抗菌活性的组 分，也因纯化不过关而难以获得其相应的基因，使得采用基因工程手段规模化生产该强活 性组分不能实现。