[发明专利]一种磁珠标记的氯霉素免疫检测体系

说明书

技术领域

本发明涉及一种磁性分离技术和酶联免疫检测技术，具体的说是一种利用磁珠标记配合酶联免疫检测方法对待检样品中氯霉素残留量进行测定的方法。 

背景知识 

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是20世纪中叶发现的一种广谱抗生素，对革兰氏阴性菌和阳性菌均有很好的抑制作用。由于其优良的抗菌性、稳定的药性和低廉的价格，曾在一段时期内作为细菌性疾病的治疗药物应用与人和动物临床，并作为饲料添加剂广泛应用于畜牧业生产。然而，在使用中人们发现氯霉素具有毒性，CAP在动物性食品中的残留直接危害着人们的健康和生命安全。特别是人体接触后后果严重，能产生再生障碍性贫血、其他恶性血液病等毒副作用，对人类的健康构成巨大的潜在威胁。美国最早规定不允许在家禽饲养中使用CAP，出售的家禽必须做CAP残留检测。鉴于健康原因，联合国粮农组织(FAO)、世界卫生组织(WHO)和许多国家规定禁止将CAP用于食品动物，中国同样已经禁止使用CAP，并且规定CAP的检测限量值：牛奶0.25ng/mL、肉类1.5ng/g、尿液1.0ng/mL、血清0.5ng/mL、蜂蜜(快检)1.5ng/g、蜂蜜(C18柱)0.1ng/g，并且我国农牧发[2001]24号文同样规定，在马肝、鸡肉、真鲷肌肉中的氯霉素残留限量为不得检出；欧盟的进口食品卫生标准同样规定氯霉素含量标准为不得检出；目前美国食品及药物管理局(FDA)和芬兰进一步规定CAP的最高残留限量(RML)为0，即不得检出，但是各种CAP的检测方法都有检测极限，不能达到0。 

目前CAP的检测方法很多。其中气相色谱法和液相色谱法，灵敏度高，其检测极限可以达到0.7ng/mL，但样品前处理过程相对复杂，仪器化程度高且价格昂贵，分析速度慢，不适合在基层推广使用及大量样本筛选；微生物法经济、简单，但灵敏度有限，且缺乏特异性；放射免疫分析法适用于肉蛋奶，检测限约为200ng/kg，但具有同位素半衰期短，存在放射性污染等缺点。而ELISA方法具有灵敏度高，特异性强，仪器设备要求低和样本前处理相对简单等优点，适于现场监控和大量样本筛选。据目前文献报道，常规的ELISA检测极限是0.1ng/mL。但是，随着人们对健康状况要求的不断提高，CAP的最高残留限量(RML)同样也将会跟美国和芬兰一样达到0ng/mL。那么目前的各种检测体系都将不能达到这 个要求，因此需要一种检测灵敏度更高测定方法。 

免疫磁珠(Immunomagnctic beads，IMB)是免疫学和磁载体技术相结合而发展起来的一类新型材料。IMB是包被有单克隆抗体的磁性微球，可与含有相应抗原的靶物质特异性地结合形成新的复合物，通过外加磁场的作用，使磁球和上清快速分离，可以在短时间内得到浓缩、纯净的待测样品，缩短检测时间，提高检测效益和灵敏度。目前，MB-ELISA检测方法是免疫磁珠在免疫检测领域最主要的应用，其采用免疫磁珠配合常规ELISA方法主要用于免疫检测、细胞和微生物的分离和蛋白质、DNA、RNA以及mRNA等生物大分子纯化检测，其基本步骤为：一、用抗原和磁珠进行偶联，制备免疫磁珠。二、将检测样品和第一种抗体(简称一抗)按一定比例混合，然后在其中加入适量体积的第一步制备出的免疫磁珠，使免疫磁珠上的抗原和样品中的抗原竞争结合一抗，然后通过磁性分离，除去上清。三、加入一定体积的过氧化物酶标记过的二抗，然后放在37℃条件下温育1小时，再通过磁性分离，除去上清。四、加底物显色15分钟，把显色液移入96孔ELISA反应板中，放入酶标仪中读数。 

这种方法对大分子抗原具有良好的检测效果，但是对有关氯霉素等小分子的检测实例尚未见报道。经过实验表明，用MB-ELISA检测方法检测灵敏度要比一般的直接竞争抑制ELISA方法高，但是检测的重复性不好，稳定性差，并不适用于检测氯霉素等小分子。 

发明内容

针对上述现状，本发明的目的在于提供一种与常规酶联免疫检测方法相比，检测CAP样品灵敏度更高，并且重复性好，检测数据的稳定性高的氯霉素检测方法。 

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种磁珠标记的氯霉素免疫检测体系，其特征在于，制备特异性强的抗-CAP单克隆抗体，然后将其与磁珠偶联进一步制备出包被有抗-CAP单克隆抗体的免疫磁珠；利用制备出的免疫磁珠吸附待检CAP样品中的CAP分子，再通过磁性分离技术去除上清，然后用挥发性有机溶剂抽提免疫磁珠中吸附的CAP分子，并将其配备成浓缩的CAP样品，最后用直接竞争抑制ELISA方法对浓缩的CAP样品进行检测得出结果。