[发明专利]利用家蚕中部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法

权利要求书

1、一种利用家蚕中部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法，其特征在于：在家蚕中部丝腺组织提取液中加入pUC19-Ser1-PolyA重组质粒或pUC19-Ser1-GFP-PolyA重组质粒或插有外源基因的以上任一种重组质粒，加入蛋白酶抑制剂，25℃～29℃水浴，即得目的蛋白的表达。

2、根据权利要求1所述的利用家蚕中部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法，其特征在于所述家蚕中部丝腺组织提取液的制备方法包括：

(1)取四龄或五龄家蚕，将家蚕浸于75％乙醇中麻醉，解剖取出丝腺，置于0.9℅的生理盐水或PBS中，取中部丝腺，—80～—60℃保存；

(2)取以上保存的中部丝腺，置于匀浆器中，加入生理盐水或PBS，冰上匀浆；取匀浆液于1.5ml EP管中，2℃～6℃，10000～14000rpm离心10～15min，取上清，重复三次，取上清，即为家蚕中部丝腺组织提取液。

3、根据权利要求1所述的利用家蚕中部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法，其特征在于所述pUC19-Ser1-PolyA重组质粒的构建，其特征包括以下步骤：

(1)以家蚕基因组DNA为模板，L-1和L-2为引物，PCR扩增出Ser1启动子序列，经EcoR I和BamHI双酶切后定向克隆至载体pUC19中，获得重组质粒pUC19-Ser1；

L-1：5′-ccggaattcgaaattcttagctacatct-3′；

L-2：5′-ggcggatccccgggtaccgagctcgttggcggtctttggatc-3′；

(2)以家蚕基因组DNA为模板，L-3和L-4为引物，PCR扩增出Ser1 polyA(1)，经SalI和HindIII双酶切后定向克隆至pUC19-FL中pUC19-Ser1启动子下游，获得重组质粒pUC19-Ser1-PolyA；

L-3：5′-gcggtcgacctgcaggcatgcggttccagcacaagtggaggag-3′；

L-4：5′-gccaagcttgataatacgtttattatct-3′。

4、根据权利要求1所述的利用家蚕中部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法，其特征在于所述pUC19-Ser1-GFP-PolyA重组质粒的构建，其特征包括以下步骤：

(1)按权利要求3所述步骤(1)获得重组质粒pUC19-Ser1；

(2)以家蚕基因组DNA为模板，以L-5和L-6为引物，PCR扩增出Ser1 polyA(2)；

L-5：5′-gagctgtacaagtaaggttccagcacaagtggaggag-3′；

L-6：5′-gccaagcttgataatacgtttattatct-3′；

(3)，以质粒pEGFP-N1为模板，以L-7和L-8为引物，PCR扩增GFP报告基因序列；

L-7：5′-ccggtcgacctgcaggcatgcatggtgagcaagggc-3′；

L-8：5′-cacttgtgctggaaccttacttgtacagctc-3′；

(4)以Ser1 polyA(2)和GFP报告基因序列为模板，以L-7和L-6为引物，利用重叠PCR的方法扩增出带有Ser1polyA(2)和GFP报告基因序列的片段，即GFP-PolyA，经SalI和HindIII双酶切后定向克隆至重组质粒pUC19-Ser1中，获得重组质粒pUC19-Ser1-GFP-PolyA。