[发明专利]利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法无效
申请号: | 200810120477.8 | 申请日: | 2008-08-29 |
公开(公告)号: | CN101358196A | 公开(公告)日: | 2009-02-04 |
发明(设计)人: | 张耀洲;夏佳音;陈健;吕正兵;陈琴;聂作明;盛清 | 申请(专利权)人: | 浙江理工大学 |
主分类号: | C12N15/79 | 分类号: | C12N15/79;C12N15/66 |
代理公司: | 杭州中成专利事务所有限公司 | 代理人: | 金祺 |
地址: | 310018浙江省杭*** | 国省代码: | 浙江;33 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 利用 家蚕 后部 腺体 外表 系统 合成 蛋白质 方法 | ||
1、一种利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法,其特征在于:在家蚕后部丝腺组织提取液中加入pUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒或插有外源基因的pUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒或pUC19-FL-PolyA质粒或插有外源基因的pUC19-FL-PolyA质粒及蛋白酶抑制剂,25℃~29℃水浴,即得目的蛋白的表达。
2、根据权利要求1所述的利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法,其特征在于所述家蚕后部丝腺组织提取液的制备方法包括:
(1)取四龄或五龄家蚕,将家蚕浸于75%乙醇中麻醉,解剖取出丝腺,置于0.9%的生理盐水或PBS中,取后部丝腺,-80~-60℃保存;
(2)取以上保存的后部丝腺,置于匀浆器中,加入生理盐水或PBS,冰上匀浆;取匀浆液于1.5ml EP管中,2℃~6℃,10000~14000rpm离心10~15min,取上清,重复三次,取上清,即为家蚕后部丝腺组织提取液。
3、根据权利要求1所述的利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法,其特征在于所述pUC19-FL-PolyA质粒的制备方法包括:
(1)以家蚕基因组DNA为模板,L-1和L-2为引物,PCR扩增出fib-L启动子序列,经EcoR I和BamHI双酶切后定向克隆至载体pUC19中,获得重组质粒pUC19-FL;
L-1:5′-ccggaattccgactcgccaagttacgtc-3′;
L-2:5′-ggcggatccccgggtaccgagctcgtggtctgttatgtgacc-3′;
(2)以家蚕基因组DNA为模板,L-3和L-4为引物,PCR扩增出fib-L polyA(1),经SalI和HindIII双酶切后定向克隆至pUC19-FL中fib-L启动子下游,获得重组质粒pUC19-FL-PolyA;
L-3:5′-gcggtcgacctgcaggcatgccaaattgtgtttgcgttagg-3′;
L-4:5′-gccaagcttcactgtccaatccaccgtc-3′。
4、根据权利要求1所述的利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法,其特征在于所述pUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒的制备方法包括:
(1)以家蚕基因组DNA为模板,L-1和L-2为引物,PCR扩增出fib-L启动子序列,经EcoR I和BamHI双酶切后定向克隆至载体pUC19中,获得重组质粒pUC19-FL;
L-1:5′-ccggaattccgactcgccaagttacgtc-3′;
L-2:5′-ggcggatccccgggtaccgagctcgtggtctgttatgtgacc-3′;
(2)以家蚕基因组DNA为模板,以L-5和L-6为引物,PCR扩增出fib-L polyA(2);
L-5:5′-gagctgtacaagtaacaaattgtgtttgcg-3′;
L-6:5′-gccaagcttcactgtccaatccaccgtc-3′;
(3),以质粒pEGFP-N1为模板,以L-7和L-8为引物,PCR扩增GFP报告基因序列;
L-7:5′-ccggtcgacctgcaggcatgcatggtgagcaagggc-3′;
L-8:5′-cgcaaacacaatttgttacttgtacagctc-3′;
(4)以fib-L polyA(2)和GFP报告基因序列为模板,以L-7和L-6为引物,利用重叠PCR的方法扩增出带有fib-L polyA(2)和GFP报告基因序列的片段,即GFP-PolyA,经SalI和HindIII双酶切后定向克隆至重组质粒pUC19-FL中,获得重组质粒pUC19-FL-GFP-PolyA,
L-6:5′-gccaagcttcactgtccaatccaccgtc-3′;
L-7:5′-ccggtcgacctgcaggcatgcatggtgagcaagggc-3′。
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