[发明专利]一种高通量微生物鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物鉴定方法，尤其涉及基于PCR、蛋白纯化和高分辨串联质谱技术的高通量具有DNA、RNA或蛋白质等遗传物质的微生物鉴定方法。

背景技术

微生物传统的鉴定方法是建立在微生物的形态学、生态学、细胞生理和生化以及基因的基础上的，主要包括以下几类：生化方法、免疫学技术、分子生物学及分子遗传学方法、生物传感器、色谱技术。

上述方法都有速度慢、不适于大规模筛查鉴定的特点。它们仅仅能够鉴定事先假定存在于样品中的病原微生物。

目前，没有一种方法在不经过培养或利用特异生物体检测的前提下，就能够高通量的鉴定在一个样品中可能包含的1000多种病原体；也没有任何系统有能力对一个单个样品中的全部细菌和病毒基因组作平行分析、定量和鉴定。

目前，有美国IBIS公司的“Triangulation Identification for theGenetic Evaluation of Risks(TIGER)”系统，可以对遗传物质为DNA和RNA的病原体做高通量鉴定，而对以蛋白质为遗传物质的微生物则无能为力。国内也尚无成熟技术和装置的相关报道。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明提出了一种高通量微生物鉴定方法，包括以下步骤：

(1)取样；

(2)遗传物质提取；

(3)质谱分析；

(4)数据分析和微生物鉴定。

步骤(2)中所述的遗传物质是DNA或RNA，用核酸抽提试剂盒提取。

步骤(2)中所述的遗传物质是蛋白质，提取后将蛋白质纯化。

所述的提取物是DNA或RNA，提取后还需要扩增，其扩增步骤为：设计通用引物，进行PCR扩增。

所述的提取物是蛋白质，蛋白质纯化后经浓缩酶解。

所述的微生物为病原微生物，所提取遗传物质为DNA或RNA遗传物质，包括以下步骤：

(1)病原微生物取样；

(2)DNA或RNA遗传物质提取；

(3)将提取物扩增；

(4)提取物扩增后脱盐；

(5)质谱分析；

(6)数据分析和微生物鉴定。

所述的微生物为病原微生物，所提取遗传物质为蛋白遗传物质，包括以下步骤：

(1)病原微生物取样；

(2)蛋白遗传物质提取；

(3)将提取物富集；

(4)提取物富集后酶解；

(5)质谱分析；

(6)数据分析和微生物鉴定。

本发明的有益之处在于：

1、本发明的鉴定方法可以广泛应用，实际上能够鉴定所有生物体；

2、能够同时鉴定数千种细菌、病毒、真菌和原生动物，而别的系统仅仅在同一时间只能鉴定很少的传染性病原体，其发展将受到数量限制；

3、能够给出一个单一样品中多个病原体的相对量的多少，而目前大多数系统还没有这个能力；

4、快速而不需要培养，一个样品可在少于4小时的时间内被分析，而培养则需要数周时间，当然一些样品根本就不能够培养；

5、可分析所有媒介中的环境或临床样品，从空气到大部分复杂生物样品，这使得其非常通用；

6、不需要测序，对于传染性病原体的鉴定来说是一个性价比非常好的解决方案；

7、质谱技术的参与使其具有极高的灵敏度和分辨率；

8、由于本发明能够在不培养病原体的条件下，广泛、快速的鉴定复杂混合物中的病原微生物，因此在疾病预防控制中心(CDC)的流行病学调查，生物制药企业的污染性微生物检测，医院的院内感染监测和传染病诊断领域，以及生物反恐等诸多领域都能发挥巨大作用。

具体实施方式

下面结合实施例详细说明本发明的技术方案，应理解的是，本发明不限于这些实施例。

1、一种高通量微生物鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)取样；

(2)遗传物质提取；

(3)质谱分析；

(4)数据分析和微生物鉴定。

(一)取样

流行病学样品以及直接来源于人类咽拭子、血液、尿液、脓液、土壤和食物样品中的微生物。而且，这些样品绝大多数是多种微生物的混合物，不需要纯培养。

优点：节省时间，一般微生物得到纯培养至少需要过夜，而很多的微生物比如病毒的培养是一个更加长的周期；还有的根本就是培养不出来的。

(二)遗传物质提取

1、DNA或RNA提取