[发明专利]一种抗逆能力增强的生防真菌的构建方法及抗逆能力增强的生防真菌

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及生物工程技术领域的DNA重组技术和应用，具体涉及利用基因工程技术增强生防真菌菌株抗逆性能的方法及生防真菌。

背景技术

在自然条件下，丝孢类生防真菌最主要的侵染途径是通过体壁接触感染而致死各类害虫。此过程包括孢子在昆虫体壁上吸附、萌发产生芽管、借助于胞外酶等因素的作用穿透昆虫体壁，然后菌丝在寄主血腔中快速繁殖，终因耗尽营养而导致寄主死亡。独特的侵染方式使丝孢类杀虫真菌成为防治刺吸式口器害虫的首选生防因子。丝孢类杀虫真菌的成员很多，如Beauveria、Metarhizium、Paecilomyces和Verticillium等属的菌种，已被开发成多种制剂用于农林害虫的防治。目前全世界先后注册登记的丝孢类真菌杀虫剂60余种，正在成为无公害农业可依托的害虫防治新技术及产品来源。

真菌杀虫剂研发的首要基础是获得高效抗逆菌株，其中保持菌剂在多变环境(如环境温度、紫外辐射等)中的生物学活性一直是国际上试图通过攻关研究重点解决的技术难题之一，并日益受到生防领域的重视。为了增强菌剂的环境稳定性和生态适应性，目前的工作集中在生产技术、剂型化工艺和应用技术方面改进。首先，在生产工艺方面，研究目标由提高产量逐渐转变为优化质量性状。近年来，通过培养条件调节生产菌株的生理状态，增强菌株对田间低湿环境和暑热的耐受能力，已逐渐受到人们的关注。西南大学利用水活度调节液体种子生理状态，然后接种固体培养，获得高产、抗逆球孢白僵菌分生孢子生产新工艺，一定程度上提高了孢子粉质量，改良了孢子粉的制剂加工性能和应用性能。其次，剂型化工艺可以提高了产品的货架寿命和应用效果的稳定性。如绿僵菌油剂用于防治沙漠蝗虫，在很大程度上克服了干旱对真菌使用效果的影响。目前，已注册登记的商品制剂包括粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂、油剂等，贮存稳定性显著提高显示了良好的应用前景。浙江大学研制的白僵菌孢子乳悬剂，制剂喷雾后形成的“油包水”雾滴有利于提高孢子在环境中的存活及其对靶标害虫的附着与浸染。尽管如此，这些问题的进一步解决或者说根本解决将依赖于我们对真菌抗逆生物学分子机制的认识和代谢生理调控。

众多研究表明，环境胁迫因子(如：高温、紫外辐射等)可刺激活性氧自由基在菌体内的积累。金属硫蛋白(metallothionein，MT)是一类富含半胱氨酸(20-30％)的低分子量金属结合蛋白，不仅可以淬灭多种活性氧自由基，而且是羟自由基的高效清除剂。硫氧还蛋白(thioredoxin)在多种反应中通过可逆地调节二硫键和巯基比例起氧化还原载体的作用，可以介导氧化还原反应使失活蛋白恢复正常活性。

发明内容

本发明首先所要解决的技术问题是提供一种抗逆能力增强的生防真菌的构建方法，以增强生防真菌对环境的耐受力。

为此，本发明采用以下技术方案：它包括下列步骤：

(1)、抗逆相关基因的获得，所述抗逆相关基因为金属硫蛋白基因或硫氧还蛋白基因；

(2)、金属硫蛋白基因或硫氧还蛋白基因双元载体的构建；

(3)、将构建的双元表达载体转入生防真菌，获得重组生防真菌。

所述金属硫蛋白基因和硫氧还蛋白基因可来源于粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)、黑曲霉(Aspergillusniger)、大肠杆菌(Escherichia coli)。

在步骤(2)中，在大肠杆菌中扩增并提取真菌表达质粒pFE52，用内切酶Nco I和BamH I分别切开基因PCR产物和质粒pFE52，将金属硫蛋白基因或硫氧还蛋白基因与质粒连接。从而使抗逆相关基因分别置于构巢曲霉(Aspergillius

nidulans)3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子Pgpd和色氨酸基因的终止子TtrpC之间，然后分别与生防真菌筛选标记草丁膦抗性基因Bar表达元件串联成真菌表达载体。

在步骤(3)中，利用芽生孢子转化体系将真菌表达质粒转入生防真菌，获得组成型表达金属硫蛋白基因或硫氧还蛋白基因的重组菌株。在步骤(3)中也可利用原生质体转化、农杆菌介导转化、电击转化等遗传转化技术将构建的双元表达载体转入生防真菌，获得重组生防真菌。

所述的生防真菌可以是白僵菌、绿僵菌或拟青霉。