[发明专利]一种单增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及定量检测方法领域，特别是涉及一种单增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法。

背景技术

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)与志贺氏菌(Shigella)是重要的食源性病原菌，其中单增李斯特菌导致的李斯特菌病(Listeriosis)可引起脑膜炎、败血症和流产，孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷病人是易感人群。动物性食品是其主要传播源，该菌在4℃仍可以生长，对冷冻产品和速食食品构成潜在威胁。志贺氏菌是危害严重的肠道致病菌，在我国感染性腹泻致病菌中居首位，其导致的志贺氏菌性痢疾(shigellosis)是世界上，尤其是发展中国家重要的传染病之一。

单增李斯特菌能够引起致病是由于其产生多个毒力因子，分别为李斯特菌溶血素O，侵袭性蛋白P60，内化素A、B和转录调节子基因prfA等。由hly基因编码的李斯特菌溶血素O是单增李斯特菌最重要的致病因子，大多数PCR检测方法都将其作为靶基因，体现出了很强的特异性。志贺氏菌致病性主要由毒力质粒介导，侵袭性质粒抗原H基因ipaH以多个拷贝形式同时存在于质粒和染色体上，将其作为PCR检测靶基因具有灵敏度高、特异性强的特点。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术的缺陷，而提供一种单增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法，并提供一种用于荧光定量PCR检测单核细胞增生李斯特菌和志贺氏菌的特异性引物与探针序列。

本发明公开了一种食源性病原菌中单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)与志贺氏菌(Shigella spp)同步荧光定量PCR检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。这种单增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

(1.1)、PCR模板DNA提取：

(1.1.1)、待测样品DNA提取：取1ml待测样品进行DNA提取，取其中4个稀释度的0.1ml菌液涂布BHI平板，于37℃培养24h，进行菌落记数；1ml待测样品-12000rpm，2min，弃上清-沉淀用PBS洗两次-200μl TE重悬-加入8μl溶菌酶(10mg/ml)及2μl RNaseA(10mg/ml)，37℃水浴30min-按照UNIQ-10DNA提取试剂盒加入裂解液与蛋白酶K，55℃水浴30min-后参照UNIQ-10 DNA提取试剂盒说明书提取DNA；

(1.1.2)、菌液DNA提取：取过夜培养的菌液，采用UNIQ-10DNA提取试剂盒提取；

(1.2)、hly与ipaH质粒标准品的构建：

(1.3)、荧光定量PCR扩增及分析：将已经计算出原始拷贝数的单增李斯特菌与志贺氏菌质粒DNA，按10倍梯度稀释，取数量级10⁵copies/μl到10¹copies/μl作为模板加入25μl反应体系，在IQ^TM5荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，得到标准曲线；其中PCR扩增反应体系(25μl)：模板DNA各1μl；2×Premix ExTaq^TM12.5μl；10μmol/L引物各1μl；10μmol/L探针各0.5μl；加灭菌超纯水至25μl，反应条件：95℃ 3min；95℃ 15s；58.5℃ 1min，45个循环。

所述的单增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法，所述的hly与ipaH质粒标准品的构建，具体步骤为：

(1.2.1)、分别通过hly与ipaH引物扩增单增李斯特菌hly与志贺氏菌ipaH基因，扩增体系(25μl)：模板DNA 1μl；10×Taq缓冲液2μl；Mg²⁺1.5mmol/L；dNTPs 0.25mmol/L；上、下游引物500nmol/L；Taq DNA聚合酶2U；加灭菌超纯水至25μl，反应条件：预变性94℃ 4min；变性94℃ 30s；退火59℃30s；延伸72℃ 20s；共35个循环，最后72℃ 10min；

(1.2.2)、扩增产物先进行1.8％琼脂糖凝胶电泳，再经PCR产物纯化试剂盒纯化后，将其连入pGEM-T载体，将所得重组质粒转化DH5α菌(空质粒大肠杆菌，感受态细胞)，挑单克隆菌落培养，用质粒提取试剂盒提取质粒，进行PCR检测、电泳鉴定，DNA测序；

(1.2.3)、重组质粒进行EcoRI单酶切线性化，通过切胶回收得到的线性重组质粒经紫外分光光度计测定浓度与纯度，-20℃保存备用。