[发明专利]实时荧光定量PCR检测HCMV gBn的分型方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因的扩增与检测，特别涉及人巨细胞病毒的gBn的型别检测方法。

背景技术

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)在人群中普遍感染。大多数人原发感染无症状，成为无症状携带者，但若免疫缺损或免疫抑制可造成严重后果，如白血球减少症，肺炎，胃肠疾病，移植物功能减弱及排异，脑炎，视网膜炎等；在优生优育方面，若宫内HCMV感染，可致婴儿严重后遗症。

gB是HCMV最重要的包膜糖蛋白之一，是HCMV编码的蛋白中最具有免疫原性的一个，是中和抗体的关键靶目标并且参加细胞应答反应，是潜在的HCMV毒力因素。HCMV亚型通常以gB的型别来分类。目前临床研究认为不同的gB基因型与临床有着密切的联系，不同的gB基因型表现出不同的细胞趋向性，不同的亚型也有着不同水平的神经亲和力；如感染体内外周血白细胞时，gB1亚型在体内不感染淋巴细胞，而gB2和gB3亚型感染单核和淋巴细胞；中枢神经系统是gB2的优先感染位点。另外，gBn1型阳性者有较好的临床转归，gBn2型的患者易出现临床症状并伴有较高的抗原血症，gBn3型阳性者术后与移植物抗宿主病的严重程度呈负相关。因此对于HCMVgB的分型技术的研究是十分必要的。

目前，用于HCMV gB分型的技术大多数是限制性长度多态性分析和定性PCR，它们可对HCMV gB做出分型，但不能对其DNA进行定量。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种实时荧光定量PCR检测HCMV gBn的分型方法，在PCR反应体系中加入荧光探针，利用荧光信号积累实时监测PCR进程，进行定量定性分析确定HCMV gBn型，所用引物和探针为：

HCMV-gB1-1：5’-cggttcagtctctcaacg-3’；

HCMV-gB1-2：5’-caccacatctccgtacttg-3’；

探针HCMV-gB1-3：FAM-ttcccaaacggtcagc-BHQ1-3；；

HCMV-gB2-1：5’-ctcgtacgacgtcgtctcaa-3’；

HCMV-gB2-2：5’-cacacgcgataggggtactt-3’；

探针HCMV-gB2-3：5’-FAM-gagaatagactgac-BHQ1-3’；

HCMV-gB3-1：5’-ctcgtacgacgtctgctcaa-3’；

HCMV-gB3-2：5’-cacacgcgataggggtactt-3’；

探针HCMV-gB3-3：5’-FAM-tgagaagaaactga-BHQ1-3’；

HCMV-gB4-1：5’-tatcgtctgtctgggtgctg-3’；

HCMV-gB4-2：5’-cgttggctctatgactgacg-3’；

探针HCMV-gB4-3：5’-FAM-tgagaggagattga-BHQ1-3’。

所述的利用荧光信号积累实时监测PCR进程，其荧光通道检测选用FAM通道。

所述的方法用于检测HCMV-gBn1、HCMV-gBn2、HCMV-gBn3或HCMV-gBn4。

本发明具有以下有益效果：

1、封闭反应，无需PCR后处理，避免污染。

2、特异性强，灵敏度高。

3、采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确。

4、实时荧光定量PCR技术既可对HCMV gB进行分型，又可对其进行定量，且定量范围宽，可达到10个数量级。

5、仪器在线式实时检测，结果直观，避免人为判断。

6、可实现一管双检或多检。

7、操作安全，缩短时间，普通PCR约需要1～2天，本发明的方法一般3～4小时可完成，提高效率。

8、可用于临床检测HCMV感染人群gBn分型，预测其预后，并可用于观察HCMV活动性感染，指导临床治疗。

附图说明

图1是本发明的实施例的gBn1标准曲线；

图2是本发明的实施例的gBn2标准曲线；

图3是本发明的实施例的gBn3标准曲线；

图4是本发明的实施例的gBn4标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例来说明本发明的技术方案：

实施例1：