[发明专利]一种曼氏无针乌贼人工授精孵育方法及其专用试剂

说明书

技术领域

本发明涉及一种水产动物人工授精孵育方法及其专用的孵育试剂，特别涉及一种曼氏无针乌贼人工授精孵育方法及其专用试剂。

背景技术

曼氏无针乌贼曾是我国渔场的四大渔业之一，对温度的适应性较强，在我国沿海分布很广，是一种经济价值很高的传统渔业种类。由于过度捕捞和生态恶化，自20世纪70年代以来，先后出现了衰退现象。上世纪八十年代有报道李星颉等对曼氏无针乌贼资源及增殖的初步研究，而国外有对商乌贼的生物学及养殖方面的报道。要进行乌贼人工繁殖与育苗，首先必须进行乌贼的基础生物学的研究。而对乌贼的基础生物学的研究需要有可靠的胚胎发育的研究的支撑。只有在对胚胎发育过程的充分了解之后，才能进一步开展人工繁育与育苗的研究。而对胚胎发育的研究，最优途径就是对其胚胎进行体外培养和观察。

有关头足类早期发育阶段的基础研究，国内外报道都很少。对曼氏无针乌贼人工授精孵育的研究更是没有先例的。该类研究旨在为头足类基础生物学研究积累资料，为曼氏无针乌贼的苗种生产及存活率的提高提供理论依据。在这一基础上，可以进一步对其胚胎进行干预，使实现进一步的生产目的成为可能。

发明内容

本发明的目的是提供一种曼氏无针乌贼人工授精孵育方法及其专用试剂，以此实现对曼氏无针乌贼的离体胚胎培养的技术问题，并且该操作方法简单，成本低廉。

本发明是这样实现的：一种曼氏无针乌贼人工授精孵育方法，其将从曼氏无针乌贼雌性体内输卵管中的卵移入装有营养液的容器中进行在体外授精和离体培养，并且容器底部与卵之间设有琼脂糖层；营养液含有新鲜或冻干处理的雌性曼氏无针乌贼体的输卵管腺分泌液。

体外授精的精子来源采用雄性曼氏无针乌贼的精荚；精荚放置在琼脂糖层上，挤压以释放精子；营养液还含有血清。

该方法可按如下步骤操作：

①选取曼氏无针乌贼并采集卵和精荚，人工海水清洗待用；在培养容器中放入混合有输卵管腺分泌液的人工海水；

②将片状琼脂糖层置于培养容器底部；将步骤①的卵放在琼脂糖层上，放入精荚并且挤压精荚，进行体外授精；培育温度为26±1℃，每隔0.5小时至3小时更换营养液并且移除废弃的精荚；

③受精1天至2天后，在营养液中加入马或牛的血清；每隔15小时至30小时取出受精卵换入新的培养容器；培育期间为受精后12天至14天。

步骤①中人工海水至少暴晒三天，并且人工海水是经过微孔过滤的充气良好的海水；人工海水的盐度为27‰至28‰。

人工海水中还含有EDTA，并且人工海水中EDTA的浓度小于3克/米³。

一种曼氏无针乌贼人工授精孵育专用试剂，其含有培养容器底衬和营养液；培养容器底衬为0.2％的琼脂糖；营养液按重量份数含有1份至10份的血清和1000份的无菌海水。

无菌海水为经过微孔过滤的充气良好的海水。

无菌海水还含有EDTA，并且EDTA的浓度小于3克/米³。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明使用了使用琼脂糖衬底的培养方法，结合血清、输卵管腺分泌液混合的人工海水，开拓性的应用于曼氏无针乌贼人工授精孵育。由于传统无衬底培养方式由于容器底部质地坚硬，造成卵的变形，并且卵膜与容器底部接触面不能吸收营养物质，会导致胚胎发育畸形甚至发育停止，培养成功率极低。本技术方案由于琼脂糖分子结构疏松，营养物质能够自由流动渗透，卵在琼脂糖衬底上变形较小，而且不会造成接触面的营养缺乏。输卵管腺分泌液或血清单独使用的情况下，由于关键营养元素的缺失，仍然会出现胚胎发育停止的现象。只有在输卵管腺分泌液配以低浓度血清提供营养的条件下，并且保证卵不变形，才能使曼氏无针乌贼体外培养的胚胎顺利完成整个发育过程。

附图说明

图1是本发明实施例培养的胚胎各发育阶段的显微照片。

具体实施方式

以下结合附实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例：一种曼氏无针乌贼人工授精孵育专用试剂，其含有培养容器底衬和营养液；培养容器底衬为0.2％的琼脂糖；营养液按重量份数含有1份的血清或1份输卵管腺分泌液或其组合；营养液按重量份数还含有500份的无菌海水。在受精2天之前的培养阶段，单独使用1份的曼氏无针乌贼的输卵管腺分泌液，2天之后则采用1份血清加1份输卵管腺分泌液作为提供营养的培养液。试验表明这样才能使胚胎正常完成整个发育过程。