[发明专利]花生矮化病毒荧光定量RT-PCR检测试剂及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及检测花生矮化病毒的生物制剂，具体涉及花生矮化病毒荧光定量RT-PCR检测试剂及制备方法和应用。

背景技术

花生矮化病毒(Peanut stunt virus，PSV)属于黄瓜花叶病毒属，病毒粒体球形，直径约30nm。该病毒寄主范围较广，自然条件下可侵染花生、菜豆、大豆、烟草、苜蓿、三叶草、刺槐等作物，能够引起叶片褪绿，并发展成绿色与浅绿相间的花叶，新长出的叶片通常展开时是黄色的，但可以转变成正常绿色，叶片变窄小，叶缘有时出现波状扭曲；病株结荚少而小，有时畸形或开裂。花生矮化病毒主要靠蚜虫以非持久性方式在田间传播，也可通过蚜虫与汁液传播。目前，该病毒主要分布于美国、加拿大以及中欧等国，为我国对外公布的检疫性有害生物。

花生矮化病毒的检测方法主要包括生物学鉴定、血清学检测和逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)技术等。生物学鉴定方法耗工费时，需要隔离温室，检测周期较长；血清学方法常用的是双抗体夹心酶联检测技术，适用于多样本的初筛，具有操作简单的优点，但其检测灵敏度较低，且常常由于抗体制备的质量问题而出现非特异性反应。RT-PCR是用于检测病毒核酸的技术方法，具有较好的敏感性和特异性，但需要进行DNA电泳等PCR后处理，接触有毒试剂溴化乙锭，易发生交叉污染而造成假阳性结果。

荧光定量RT-PCR(Real-time fluorescent RT-PCR)是近几年发展起来的RT-PCR技术与荧光检测相结合的方法，其原理是使用能特异标记核苷酸序列的荧光物质，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR过程，具有检测周期短、特异性与灵敏度高以及无需PCR后处理等优点。以TaqMan水解探针为例，探针一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团，通常状态下，荧光基团与淬灭基团发生荧光共振能量转移现象，荧光基团的荧光被淬灭基团吸收。当PCR进入退火阶段时，荧光探针特异的结合在两条引物之间，在延伸阶段被聚合酶的5′端外切酶活性切开。荧光基团与淬灭基团分离，仪器检测出荧光。由于荧光信号伴随着PCR模板的扩增而增长，因此可以根据荧光信号是否增长来确定模板是否扩增。荧光PCR仪在反应过程中连续的检测荧光信号的变化，当荧光信号增强到某一阈值时，此时的循环次数(Ct)就被记录下来。该Ct值与反应体系中起始模板量的对数值有严格的线性关系。因此，除了可定性确定反应体系中是否含有目标RNA之外，还可以对反应体系中的模板RNA进行相对定量。

普通TaqMan探针的Tm值为65～72℃，片段长度为25～40nt，由于其高特异性的特点，如果探针与目标基因序列没有完全匹配，则会发生检测效率低甚至没有荧光信号的产生等问题。因此，在针对株系变异较大的病毒进行荧光RT-PCR检测时，由于难以设计长片段的完全匹配合适的荧光探针，就必须采用TaqMan MGB(Minor Groove Binder)探针技术。TaqMan MGB探针由于3′端具有MGB分子，提高了探针的Tm值，从而使探针长度缩短，以满足整个荧光RT-PCR的反应条件。

因此，研究建立特异、敏感、可对低含量PSV病毒侵染、隐性感染或持续带毒寄主进行荧光定量RT-PCR检测的方法，在检疫、诊断、分子流行病学研究等方面具有重要的实际应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种对花生矮化病毒具有特异性高、敏感性强，定量和快速检测的荧光定量RT-PCR检测试剂。

本发明还提供了该检测试剂的制备方法和应用。

本发明系选择花生矮化病毒的CP(外壳蛋白)编码基因的保守片段为靶目标，应用primer Express 3.0软件，设计合成引物和探针；将设计的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验，得到最合适的引物和探针。

本发明所述的花生矮化病毒荧光定量RT-PCR检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为76bp，引物和探针序列为：

引物：PSV TF：5′-cagatgccatccctcga-3′

      PSV TR：5′-ccaacgaagtgtacgtgtacc-3′

探针：5′-FAM-catccaacctttgtttctag-MGB-3′

本发明所述的花生矮化病毒荧光定量RT-PCR检测试剂的制备方法由下述步骤组成：

一、选择花生矮化病毒CP编码基因的保守片段为靶目标，该保守片段的扩增目标核苷酸序列为：