[发明专利]一种制备微粉化蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及由含人血管内皮抑制素的原料溶液制备固体形式的微粉化人血管内皮 抑制素的方法。特别涉及一种能得到高活性的微粉化人血管内皮抑制素的方法。

背景技术

生物技术的革新和发展使重组蛋白和多肽药物得以实现大规模的生产和应用。蛋白 与多肽在水溶液中不稳定，易失活，阻碍了将此类药物制备成药用制剂。例如将蛋白溶 液与有机溶剂接触后，由于油水界面表面张力的存在，使蛋白构象改变而失活。现有的 在蛋白原液中直接添加冻干保护剂的冷冻干燥法也可得到干燥的固态蛋白，但得到的蛋 白颗粒大，辅料占的比重大，多用于制成冻干粉针剂，用途不广泛。

在蛋白与多肽类药物给药系统的研究中，以药物微粉化为前提的剂型日益增多，这 些剂型的应用和发展，其前提和关键是药物的微粉化。但现有的生产固态蛋白的技术无 法生产出粒径小于3um的微粉化蛋白，故不能满足新剂型研发的需要。本发明独特的优 点在于：一、将蛋白制备成固态，提高了蛋白被制备成其他剂型的稳定性；二、固态的 蛋白，其粒子极小，是微粉化的固态蛋白，扩展了其制剂应用范围，不仅可用于制备粉 末注射剂，由于其粒径极小(1um以下)，还可用于制备干粉吸入剂、粉末注射剂等等。

现有微粉化蛋白的方法已经有很多，总体归纳可分为以下几种：喷雾干燥法、冷冻 干燥法、喷雾冷冻干燥法、超临界流体技术。喷雾干燥是利用雾化器将药物溶液分散为 细小的雾滴，并在热干燥介质中迅速蒸发溶剂形成干粉的过程，该技术制得的微粉粒径 均匀，但是该法需使用热空气，不适合用于干燥对温度不敏感的蛋白和多肽药物。喷雾 冷冻干燥法将喷雾干燥中的雾化步骤与冷冻干燥相结合，步骤是将雾化的药物水溶液喷 入液氮中，以冷冻干燥的步骤将其干燥，得到粒径均匀的药物微粉。该方法批处理量大， 但成本较高，得到的微粉粒径较大。超临界流体技术是新近发展的技术，可用于超临界 流体的性质来提取溶剂，干燥蛋白，但是，该技术仍存在许多需要研究和解决的问题： 如蛋白和多肽类药物在有机溶剂中的溶解度普遍较小，如何通过改变溶剂组成来增加药 物的溶解度，以及不同的操作条件与最终得到的不同性质微粉之间的关系。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有的微粉化蛋白方法中存在的问题，提供一种活性保持 良好且微粉化效率极高的微粉化蛋白方法。

本发明制备的微粉化蛋白可应用于多种用途：干粉吸入剂、粉末注射剂以及微球微 囊缓释制剂等。

本发明公开了一种制备微粉化蛋白的方法，它包括以下步骤：

(1)在含有可溶性蛋白的缓冲盐溶液中加入可溶性金属盐，然后调整该溶液的pH 至蛋白的等电点(pI)，得到蛋白的细小颗粒沉淀，蛋白溶液变为混悬液；

(2)将混悬液与冻干保护剂混合均匀后，冻干；

(3)将冻干后的固体粉块用溶剂洗涤，除去冻干保护剂，得到微粉化蛋白。

本工艺利用的原理是“等电点+金属盐”两种方法共同作用得到蛋白细小的沉淀颗 粒，适用于绝大多数可溶性蛋白。

上述可溶性蛋白可以是重组人血管内皮抑制素Endostar，重组人生长激素，干扰素 α₂-b(IFNα₂-b)，重组人胰岛素等。

本发明中利用聚乙二醇这种聚合物作为冷冻干燥的保护剂，在冻干中起到空间赋形 和稳定的作用，沉淀下来的蛋白颗粒可吸附在聚乙二醇的骨架上。

上述聚乙二醇分子量范围在1000至8000道尔顿。聚乙二醇有着良好的悬浮稳定性， 分子量范围在1000至8000道尔顿均可很好的稳定蛋白颗粒，保持其在冻干中不聚集， 不下沉。

上述微粉化蛋白的制备方法，步骤(2)中混悬液和冻干保护剂的体积比为1∶99～99∶1， 优选15∶85～90∶10；混悬液中的蛋白浓度为0.01mg/ml～500mg/ml，冻干保护剂的浓度为 1％～50％(w/v)。冻干保护剂的浓度不可小于1％，否则悬浮稳定性很差，蛋白沉淀会很 快下沉聚集；冻干保护剂的浓度过高也不适合，因为冻干后为了得到蛋白微粉，需使用 有机溶剂洗涤除去该保护剂，若保护剂占的比例过高，需消耗大量有机溶剂，反复清洗， 给操作带来不便。保持1％～50％(w/v)的浓度较适宜。

上述微粉化蛋白的制备方法，步骤(3)中的洗涤溶剂是可溶解聚乙二醇的溶剂， 例如：丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈。优选乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈。