[发明专利]锰离子诊断/测定试剂盒及锰离子浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种锰离子诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定锰离子浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

锰作为一种微量元素在人体中是不可或缺的必需成分，同时也是对人体有毒的物质。在自然状态下，以两价、三价和四价的形式存在，氧化程度越低，毒性越高。通常锰有八种不同的氧化状态。锰的生物学意义是作为人体中辅助因子有多种多样的功能。然而，在许多酶激活反应中，Mn²⁺和Mg²⁺可互相替代。

常用石墨炉原子吸收分光光度测定法、原子发射ICP-OES。中子激发分析(NAA)是最好的方法，但仅能在一些条件好的实验室才能测定。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶倍增法(Enzymatic DoublingMethod)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(CoupleReaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定锰离子浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的锰离子诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行锰离子浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明锰离子浓度测定方法原理如下：

草酸+氧草酸氧化酶/Mn²⁺二氧化碳+过氧化氢

二氧化碳+乙酰辅酶A+还原型辅酶丙酮酸脱氢酶丙酮酸+

                                      辅酶A+辅酶

丙酮酸+精氨酸+还原型辅酶章鱼碱脱氢酶

                N2-(D-1-羧乙基)-L-精氨酸+辅酶+水

这种方法应用需要锰离子激化活性的草酸氧化酶(oxalate oxidase；EC1.2.3.4)酶(偶)联丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase；EC 1.2.1.51)、章鱼碱脱氢酶(Octopine dehydrogenase；EC 1.5.1.11)酶促反应速率比色法。草酸氧化酶的激活程度与锰离子的浓度成正比。草酸氧化酶酶解草酸反应产生二氧化碳，再通过(偶)联合丙酮酸脱氢酶、章鱼碱脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算锰离子的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明锰离子诊断/测定试剂盒较为理想：

缓冲液                  100mmol/L

稳定剂                             500mmol/L

还原型辅酶                         0.25mmol/L

草酸氧化酶                         6000U/L

丙酮酸脱氢酶                       8000U/L

章鱼碱脱氢酶                       10000U/L

草酸                               12mmol/L

乙酰辅酶A                          6mmol/L

精氨酸                        12mmol/L

本发明的锰离子诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、章鱼碱脱氢酶、草酸、乙酰辅酶A、精氨酸。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酸、乙酰辅酶A、精氨酸。

试剂2

缓冲液、稳定剂、草酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、章鱼碱脱氢酶。