[发明专利]锰离子诊断/测定试剂盒及锰离子浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种锰离子诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定锰离子浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

锰作为一种微量元素在人体中是不可或缺的必需成分，同时也是对人体有毒的物质。在自然状态下，以两价、三价和四价的形式存在，氧化程度越低，毒性越高。通常锰有八种不同的氧化状态。锰的生物学意义是作为人体中辅助因子有多种多样的功能。然而，在许多酶激活反应中，Mn²⁺和Mg²⁺可互相替代。

常用石墨炉原子吸收分光光度测定法、原子发射ICP-OES。中子激发分析(NAA)是最好的方法，但仅能在一些条件好的实验室才能测定。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定锰离子浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的锰离子诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行锰离子浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明锰离子浓度测定方法原理如下：

草酰乙酸草酰乙酸脱羧酶/Mn²⁺丙酮酸+二氧化碳

还原型辅酶+核糖-5-磷酸+二氧化碳磷酸葡糖酸脱氢酶

                磷酸葡糖酸+辅酶

这种方法应用需要锰离子激化活性的草酰乙酸脱羧酶(oxaloacetatedecarboxylase；EC 4.1.1.3)酶(偶)联磷酸葡糖酸脱氢酶(phosphogluconatedehydrogenase；EC 1.1.1.44)酶促反应连续监测法/速率比色法。草酰乙酸脱羧酶的激活程度与锰离子浓度成正比。锰离子激化活性下的草酰乙酸脱羧酶酶解草酰乙酸反应产生二氧化碳，再通过(偶)联合磷酸葡糖酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算锰离子的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明锰离子诊断/测定试剂盒较为理想：

缓冲液                           100mmol/L

稳定剂                           500mmol/L

还原型辅酶                      0.25mmol/L

草酰乙酸脱羧酶                     6000U/L

磷酸葡糖酸脱氢酶                   8000U/L

草酰乙酸                          12mmol/L

核糖-5-磷酸                        9mmol/L

本发明的锰离子诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸脱羧酶、磷酸葡糖酸脱氢酶、草酰乙酸、核糖-5-磷酸。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸、核糖-5-磷酸。

试剂2

缓冲液、稳定剂、草酰乙酸脱羧酶、磷酸葡糖酸脱氢酶。

还原型辅酶、草酰乙酸脱羧酶、磷酸葡糖酸脱氢酶、草酰乙酸、核糖-5-磷酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸、核糖-5-磷酸。

试剂2

缓冲液、稳定剂、磷酸葡糖酸脱氢酶。

试剂3

缓冲液、稳定剂、草酰乙酸脱羧酶。