[发明专利]单胺氧化酶诊断试剂盒及单胺氧化酶活性浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种单胺氧化酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定单胺氧化酶活性浓度的方法，属于医学检验测定技术领域。

背景技术

单胺氧化酶(MAO)测定可分为化学分光光度法、荧光法、免疫抑制法及现在申请专利的酶法。一般多用化学分光光度法，单胺氧化酶反应底物以苄胺(Benzylamine)和对苯甲胺-β-偶氮萘酚，也可应用单胺氧化酶催化胺类释放出的H₂O₂氧化发色剂，如10-N-甲基氨基甲酰基-3，7-二甲氨基-10-氢-吩噻嗪(MCDP)。除此之外，单胺氧化酶反应底物还有丁基胺(butylamine)、戊基胺(amylamine)、β-苯乙基胺(b-phenylethylamine)、酪胺(tyramine：3-对羟基苯乙胺3-parahdroxyphenylethylamine)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine)等，丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺约为3-对羟基苯乙胺活性的30％，通常应用苯甲胺作为底物比其他底物的单胺氧化酶活性要高。目前单胺氧化酶测定多用苄胺和对苯甲胺-β-偶氮萘酚为底物，但对苯甲胺-β-偶氮萘酚苄胺法需要用环乙烷提取，限制了该方法的实用性，且不能应用全自动生化仪分析；苄胺法的原理是苄胺在单胺氧化酶的作用下生成苄醛，然后在强碱性氢氧化钠的条件下与二硝基苯肼反应，生成醛苯腙，在生化仪上测定也较困难。

荧光法检测单胺氧化酶是以β-苯乙胺作为底物，其在10~100mg时Km最大，高于苄胺和5-羟色胺的Km值。

免疫学方法是利用单胺氧化酶抗体与单胺氧化酶发生反应，作用后进行单胺氧化酶同工酶测定。目前应用较多的单克隆抗体是MAO-A3C9、MAO-A4F10、MAO-A7B10、MAO-A7E10和MAO-B1C2等。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定单胺氧化酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的单胺氧化酶诊断试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行单胺氧化酶活性浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明单胺氧化酶活性浓度测定方法原理如下：

胺类化合物+水+氧 单胺氧化酶 相应醛类产物+氨+过氧化氢

二氧化碳+乙酰磷酸+过氧化氢 丙酮酸氧化酶 磷酸根+丙酮酸+氧+水

丙酮酸+二氧化碳+还原型辅酶 苹果酸脱氢酶(脱羧化)苹果酸+辅酶

这种方法应用单胺氧化酶(Monoamine Oxidase；EC 1.4.3.4；EC 1.4.3.6)酶(偶)联丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase；EC 1.2.3.3)、苹果酸脱氢酶(malatedehydrogenase(decarboxylating)；EC 1.1.1.38；EC 1.1.1.39；EC 1.1.1.40；EC1.1.1.83)酶促反应连续监测法。单胺氧化酶酶解胺类化合物反应产生过氧化氢，再通过(偶)联合丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算单胺氧化酶的活性浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明单胺氧化酶诊断试剂较为理想：

缓冲液                            100mmol/L

稳定剂                            500mmol/L

还原型辅酶                        0.25mmol/L

丙酮酸氧化酶                      10000U/L

苹果酸脱氢酶                      10000U/L

胺类化合物                        10mmol/L