[发明专利]一种量子点标记的间接竞争荧光免疫检测双氟米松的方法

权利要求书

1.一种量子点标记的间接竞争荧光免疫检测双氟米松的方法，其特征在于： 具有如下步骤；

(一)采用下述方法，用变性牛血清蛋白dBSA包裹发绿光的QD650标记 抗双氟米松多克隆抗体

(1)BSA变性：

将16.5mg BSA溶于10mL双蒸水中，搅拌下加入0.42mg NaBH₄，室温下 反应1h，60-80℃下加热20min，分解过量的NaBH₄，BSA变性，二硫键打开成-SH， 控制最终的dBSA水溶液的浓度为5×10^-5M；

(2)变性BSA包裹量子点dBSA-QDs：

将dBSA和量子点镝化铬CdTe按摩尔比1∶1～1∶6混合，60-80℃水浴加 热15min，室温下保持两天，使包裹完全；

(3)变性BSA包裹量子点偶联抗体

将5μL1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺EDC 0.056M与5μL硫代N- 羟基琥珀酰亚胺sulfo-NHS 0.1M混合10s后，加入至25μLdBSA-QDs 2×10^-5M 中，变性BSA包裹的量子点活化15min，加入9.6μL双氟米松抗体Ab 5×10^-5M， 反应物摩尔比控制为：dBSA-QDs∶Ab＝1∶1， dBSA-QDs∶EDC∶sulfo-NHS＝1∶560∶1000，室温下反应4h，得到量子点标记的双氟 米松抗体，反应液中抗体的浓度为1.03mg/mL，用0.1％明胶的含吐温的pH7.4、 0.01M磷酸盐缓冲液作抗体稀释液稀释1000倍待用；

(二)抗原的包被

用双氟米松与卵血清白蛋白偶连体作为包被原，用pH 9.6、0.05M碳酸盐缓 冲液作为包被缓冲液，用包被缓冲液将双氟米松包被原稀释至1-20μg/mL作为 包被液，在酶标板的每孔中加100μL包被液，4℃冰箱过夜，用含NaCl 8.5g/L、 pH 7.2-7.4、10mmol/L磷酸盐缓冲液洗三次，按200μL/孔加0.1％明胶进行封闭；

(三)抗原-抗体二元发光免疫复合体的形成

在封闭后的酶标板孔中加入双氟米松标准溶液或待测样品50μL，稀释的量 子点标记的双氟米松抗体50μL，37℃孵育1h，抗原与双氟米松药物竞争抗体， 部分抗体与抗原形成抗原-抗体二元免疫复合物，用含NaCl 8.5g/L、pH 7.2-7.4、 10mmol/L磷酸盐缓冲液洗三次，去掉非特异性吸附；

(四)定量荧光检测

用荧光酶标仪激发并检测所形成的抗原-抗体发光免疫复合物的荧光强度， 激发波长：430nm；发射波长：650nm，通过与标准溶液对比求出待测样品中双 氟米松的浓度。