[发明专利]一种量子点标记的间接竞争荧光免疫检测糖皮质激素多残留的方法

权利要求书

1.一种量子点标记的间接竞争荧光免疫检测糖皮质激素多残留的方法，其 特征在于，具有如下步骤：

(一)采用下述方法，用变性牛血清蛋白dBSA包裹三种量子点QD545、 QD590或QD650分别标记的糖皮质激素多克隆抗体：抗地塞米松、抗倍他米松 或抗双氟米松多克隆抗体

(1)BSA变性：

将16.5mg BSA溶于10mL双蒸水中，搅拌下加入0.42mg NaBH₄，室温下 反应1h，60-80℃下加热20min分解过量的NaBH₄，BSA变性，二硫键打开成-SH， 控制最终的dBSA水溶液的浓度为5×10^-5M；

(2)变性BSA包裹量子点dBSA-QDs：

将dBSA和量子点镝化铬CdTe按摩尔比1∶1混合，60-80℃水浴加热15min， 室温下保持两天，使包裹完全；

(3)变性BSA包裹量子点偶联抗体

将5μL1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺EDC 0.056M与5μL硫代N- 羟基琥珀酰亚胺sulfo-NHS 0.1M混合10s后，加入至25μL dBSA-QDs 2×10^-5M 中，变性BSA包裹的量子点活化15min，加入12μL三种糖皮质激素抗体Ab 中的一种，4.0mg/mL；反应物摩尔比控制为：dBSA-QDs∶Ab∶EDC∶ sulfo-NHS＝1∶1∶560∶1000，室温下反应4h，得到量子点标记的糖皮质激素抗体， 反应液中抗体的浓度为1.0mg/mL，用0.1％明胶的含吐温的pH 7.4、0.01M磷酸 盐缓冲液作抗体稀释液稀释1000倍待用；变性BSA包裹量子点分别与三种多 克隆抗体进行偶联；

(二)抗原的包被

用地塞米松、倍他米松或双氟米松与卵血清白蛋白偶连体作为包被原，用 pH9.6、0.05M碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，用包被缓冲液将糖皮质激素包被 原稀释至1-20μg/mL作为包被液，在酶标板的每孔中加100μL包被液，4℃冰箱 过夜，用pH 7.2-7.4、含NaCl 8.5g/L的10mmol/L磷酸盐缓冲液洗三次，按200μL/ 孔加0.1％明胶进行封闭；

(三)抗原-抗体二元发光免疫复合体的形成

在封闭后的酶标板孔中加入糖皮质激素标准溶液或待测样品50μL，稀释的 量子点标记的糖皮质激素抗体50μL，37℃孵育1h，抗原与糖皮质激素药物竞争 抗体，部分抗体与抗原形成抗原-抗体二元免疫复合物，用含NaCl 8.5g/L、pH 7.2-7.4的10mmol/L磷酸盐缓冲液洗三次，去掉非特异性吸附；

(四)定量荧光检测

用荧光酶标仪激发并检测所形成的抗原-抗体发光免疫复合物的荧光强度， 激发波长：430nm；发射波长：545nm、590nm或650nm，通过与标准溶液对比 求出样品中糖皮质激素多残留地塞米松、倍他米松或双氟米松的浓度。