[发明专利]锰离子诊断/测定试剂盒及锰离子的浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种锰离子诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定锰离子浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

锰作为一种微量元素在人体中是不可或缺的必需成分，同时也是对人体有毒的物质。在自然状态下，以两价、三价和四价的形式存在，氧化程度越低，毒性越高。通常锰有八种不同的氧化状态。锰的生物学意义是作为人体中辅助因子有多种多样的功能。然而，在许多酶激活反应中，Mn²⁺和Mg²⁺可互相替代。

常用石墨炉原子吸收分光光度测定法、原子发射ICP-OES。中子激发分析(NAA)是最好的方法，但仅能在一些条件好的实验室才能测定。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用间接的酶循环扩增法(IndirectEnzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定锰离子浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的锰离子诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行锰离子浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明锰离子浓度测定方法原理如下：

草酸+氧草酸氧化酶/Mn²⁺二氧化碳+过氧化氢

二氧化碳+乙酸+亚铁细胞色素b1  丙酮酸脱氢酶  丙酮酸+

                                    高铁细胞色素b1+水

丙酮酸+辅酶A+辅酶  丙酮酸脱氢酶  二氧化碳+乙酰辅酶A+

                                          还原型辅酶

这种方法应用需要锰离子激化活性的草酸氧化酶(oxalate oxidase EC 1.2.3.4)酶(偶)联丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase；EC 1.2.2.2)、第二个丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase；EC 1.2.1.51)酶促反应速率比色法。草酸氧化酶的激活程度与锰离子的浓度成正比。草酸氧化酶作为作用酶，功能为将草酸酶解产生二氧化碳。第一个丙酮酸脱氢酶(EC 1.2.2.2)也是作用酶，功能为将二氧化碳酶解产生丙酮酸。第二个丙酮酸脱氢酶(EC 1.2.1.51)作为循环酶又同时作为显色酶；作为循环酶：丙酮酸脱氢酶(EC 1.2.1.51)的酶促作用使丙酮酸再次变回二氧化碳，使二氧化碳不断地被重复循环利用，并不断地循环产生丙酮酸。丙酮酸脱氢酶EC 1.2.1.51)作为显色酶：将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量340nm处吸光度上升的速度，可以测算出锰离子的浓度。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明锰离子诊断/测定试剂盒较为理想：

缓冲液        100mmol/L

稳定剂        500mmol/L

辅酶          3mmol/L

草酸氧化酶    10000U/L

丙酮酸脱氢酶                     12000U/L

丙酮酸脱氢酶                     12000U/L

草酸                             15mmol/L

乙酸                             12mmol/L

亚铁细胞色素b1                   5mmol/L

辅酶A                            3mmol/L

本发明的锰离子诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、辅酶、草酸氧化酶、二个不同的丙酮酸脱氢酶、草酸、乙酸、亚铁细胞色素b1、辅酶A。