[发明专利]从心肌中提取纯化高铁肌红蛋白还原酶的方法

权利要求书

1.一种从心肌中提取纯化高铁肌红蛋白还原酶的方法，其步骤如下：

1)将新鲜动物心肌剁碎，加水匀浆处理，粗匀浆用2N NH₄OH把pH调至7.5，静置离心、过滤后得粗提液；

2)粗提液经40％-70％硫酸铵盐析，得到的沉淀用平衡缓冲液重悬，离心后取上清液对平衡缓冲液透析，透析膜的截留分子量为14000，得透析液；所说的平衡缓冲液是0.02M磷酸缓冲液，pH6.0；

3)将透析液上样到用0.002M、pH7.0，含0.001M EDTA的磷酸盐缓冲液平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱，用同样的缓冲液冼脱杂蛋白，流速为30ml/h，2ml/管，再用0.002M、pH7.0，含0.001M EDTA的磷酸盐缓冲液和0.2M、pH7.0，含0.001M EDTA磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，流速为20ml/h，3ml/管，收集合并酶活性部分，浓缩；

4)将浓缩一定体积的酶液在0.02M、pH6.0磷酸缓冲液中透析，22000g离心30min后，将透析液上样到用0.02M、pH6.0磷酸缓冲液平衡过夜的CM-Sephadex FastFlow阳离子交换层析柱；用同样的缓冲液洗脱杂蛋白，流速为20ml/h，待洗脱完后，用0.2M、pH6.0磷酸缓冲液洗脱，流速为30ml/h，3ml/管，收集合并酶活性部分，浓缩；

5)将浓缩的上述酶液在缓冲液E中透析，22000g离心30min后，将上清液上样到用同样缓冲液E平衡的蓝色琼脂糖凝胶FF亲和层析柱；用缓冲液E洗脱杂蛋白，流速为12ml/h，待洗脱完后，用缓冲液E和含1.0M NaCl的缓冲液E进行线性梯度洗脱，流速为18ml/h，2ml/管，收集合并酶活性部分，即得到纯化的高铁肌红蛋白还原酶；所说的缓冲液E是0.03M、pH6.0，含0.001M EDTA的磷酸盐缓冲液；

6)：得到的纯化的高铁肌红蛋白还原酶液经透析后，冷冻干燥，-80℃分装保存。