[发明专利]不结球白菜硝酸还原酶基因BcNR

权利要求书

1.不结球白菜硝酸还原酶基因BcNR，该基因的cDNA序列为SEQ ID NO.1。

2.权利要求1所述的不结球白菜硝酸还原酶基因BcNR所编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

3.权利要求1所述的不结球白菜硝酸还原酶基因BcNR的应用，包括：

1)BcNR基因cDNA的克隆

选用对硝酸盐诱导敏感的不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis)品种‘苏州青’，待幼苗长至三片真叶时提取叶片中RNA，将总RNA反转录成cDNA；

设计三对特异引物：

NRF1/NRR1：SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4，

NRF2/NRR2：SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6，

NRF3/NRR3：SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8，

以上述cDNA为模板，分别PCR扩增BcNR基因中间片段，扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃复性30sec，72℃延伸1min 30sec，35个循环后，72℃总延伸10min，将PCR产物分别连接到pMD18-T载体上，转化DH5α细胞，进行序列测定获得BcNR基因三个中间特异片段；

按照Invitrogen公司3’RACE试剂盒说明书将总RNA反转录成3’RACE cDNA；设计3′RACE两条正向引物：NR3RACE1：SEQ ID NO.9和NR3RACE2：SEQ ID NO.10，分别与试剂盒中的引物3’AUAP配对进行巢式PCR扩增；第一轮PCR产物稀释10倍作为模扳进行第二轮巢式扩增；扩增程序同上，复性温度分别为58℃和62℃；转化测序，得到BcNR基因3’末端序列；

按照Invitrogen公司5’RACE试剂盒说明书设计5′端反转录特异引物为NR5RACE1：SEQ ID NO.11，将总RNA反转录成5’RACE cDNA，并在5’末端加“C”，设计两条反向引物NR5RACE2：SEQ ID NO.12和NR5RACE3：SEQ ID NO.13，分别与试剂盒中的引物5’AAP和5’AUAP配对，以5’RACE cDNA为模板，进行巢式PCR扩增；第一轮PCR产物稀释10倍作为模扳进行第二轮巢式扩增；扩增程序同上，复性温度分别为60℃和63℃，转化测序，得到BcNR基因5’末端序列；

将所得的BcNR基因三个中间特异片段与3′端序列和5′端序列拼接得到BcNR基因全长SEQ ID NO.1；2)BcNR基因正义表达载体的构建

根据拼接的BcNR全长cDNA序列SEQ ID NO.1设计特异引物SP1/AP1：SEQ ID NO.14/SEQ ID NO.15两端引入Kpn I和Sma I两个酶切位点，使用高保真HotStar DNA聚合酶扩增BcNR的编码区序列，扩增程序为：98℃预变性10S，55℃复性15S，72℃延伸3min，共35个循环，最后72℃保温10min，最后Taq酶72℃保温10min末端加A后将其克隆至中间载体pGEM-T，利用引入的Kpn I和Sma I酶切位点进一步克隆至植物表达载体pCAMBIA2301，测序鉴定，得到重组质粒pCAM-BcNR。

4.权利要求3所述的不结球白菜硝酸还原酶基因BcNR的应用中所构建的植物表达载体为pCAM-BcNR。