[发明专利]一种快速、精确的前列腺癌的检测试纸条及其制备和应用

权利要求书

1、一种前列腺癌的检测试纸条，其特征是由PVC底板(1)，玻璃纤维膜加样垫(2)，结合垫(3)，硝酸纤维素膜(4)和吸水垫(5)组成，在硝酸纤维素膜(4)上依次点成线状或带状的鼠抗人IgG检测抗体检测线一(6)，PSA检测抗体检测线二(7)，β-肌动蛋白检测抗体控制线(8)。

2、权利要求1所述的检测试纸条的制备方法，其特征是：

(1)选择载体：所选载体为粒径在10～400nm的彩色纳米微球，该载体微球上必须含有可供偶联的免疫配基：羧基、羟基、氨基或醛基；

(2)制备免疫微球：先用无水吗啉乙磺酸对彩色纳米微球进行预处理，将少量的碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入到微球溶液中，在振荡器上震荡活化微球；分别用黑色纳米微球偶联抗人PSA抗体、蓝色纳米微球偶联AMACR抗原，用橙色纳米微球偶联抗人β-肌动蛋白抗体作为内参；然后将三种免疫纳米微球表面没有完全反应的活化基团进行封闭，以降低在以后试验中可能发生的非特异性吸附；再将微球重悬在保存液中，制成浓度为2mg/mL的微球溶液，进行保存，保存液的配方为：pH 9.0、含0.05％Tween-20、0.1％NaN₃和0.1％BSA的0.005M硼酸盐缓冲体系；最后将黑、蓝和橙三种彩色免疫纳米微球等质量混合制成一种黑蓝橙三色混合免疫纳米微球；

(3)检测试纸条的构建：

抗体的包被：在硝酸纤维膜上，用点膜器以1μL/cm的量将2mg/mL的鼠抗人IgG单克隆抗体溶液点成线状或带状检测线一，抗体事先溶解于0.15M、pH 7.4磷酸盐缓冲液中，溶液中含蔗糖量为1％；以同样的方法再标记上PSA检测抗体检测线二，和β-肌动蛋白检测抗体控制线，然后放于干燥密闭的37℃烘箱中烘烤30分钟，取出后放于干燥皿中待用；

构成结合垫：将步骤(2)制备的黑、蓝和橙彩色免疫纳米微球等质量混合制成一种黑蓝橙三色混合免疫纳米微球，用移液枪将10～40μL、浓度为2mg/mL混合后的三色免疫纳米微球滴在玻璃纤维膜上，并干燥，构成结合垫；

试纸条的组建：将层析试纸条的各个部件叠合：在PVC底板(1)上依次叠合玻璃纤维膜加样垫(2)，结合垫(3)，硝酸纤维素膜(4)和吸水垫(5)，然后切成75mm×3mm条形的检测试纸条。

3、根据权利要求2所述的制备方法，其特征是彩色纳米微球进行预处理，以pH 5.0、含0.05％Tween-20的0.01M无水吗啉乙磺酸-吐温溶液MEST，作为活化缓冲溶液，取2mg蓝色纳米微球于2mL离心管中，加入500μL活化缓冲液洗涤：在漩涡振荡器上混合均匀，再以每分钟13000转离心30分钟，把上清液倒掉；加入500μL活化缓冲液重新同样操作洗涤微球两遍后，向微球中加入485μl活化缓冲液再加入碳化二亚胺与浓度为0.25g/mL的N-羟基琥珀酰亚胺各2.5mg，在漩涡振荡器上混合均匀，室温反应30分钟后，用MEST活化缓冲液同样操作洗涤除去未反应的活化剂，再更换离心管，并用MEST活化缓冲液同样操作洗涤微球两遍。

4、根据权利要求2所述的制备方法，其特征是制备彩色免疫纳米微球：

A)、将AMACR与蓝色纳米微球偶联

偶联：以500μL、pH 9.0、含0.05％Tween-20的0.005M的硼酸盐吐温缓冲液BST溶液作偶联缓冲液同样操作洗涤微球两遍；加475μL偶联缓冲液重悬洗涤后的微球，再加入1501μg的AMACR室温反应3小时，将AMACR偶联于微球表面；

B)、将PSA抗体与黑色纳米微球偶联

将AMACR改为用PSA，将蓝色纳米微球改为用黑色纳米微球，其余操作同步骤A；

C)、将β-肌动蛋白检测抗体与橙色纳米微球偶联

将AMACR改为用β-肌动蛋白，将蓝色纳米微球改为用橙色纳米微球，其余操作同步骤A。

5、根据权利要求2所述的制备方法，其特征是免疫纳米微球的封闭：加入500μL的1％牛血清白蛋白BSA，BSA事先溶解在硼酸盐吐温缓冲液中，对免疫纳米微球表面没有完全反应的活化基团进行封闭，并且通过BSA的物理吸附，封闭其它的空间位点，以降低在以后试验中可能发生的非特异性吸附，室温下封闭反应30分钟。