[发明专利]抗血吸虫单克隆抗体NP11－4单链抗体及其制备方法、应用

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种抗血吸虫单克隆抗体NP11-4单链抗体及其制备方法、 应用，属于基因工程技术，制备抗血吸虫病单链抗体。单链抗体基因片段来自定 位于日本血吸虫成虫表膜、尾蚴膜、童虫膜、虫卵卵壳及卵内毛蚴膜的单克隆抗 体NP11-4，利用基因工程技术扩增轻链、重链可变区基因，以V_H-linker-V_L形 式将其与原核表达载体连接，制备单链抗体，用于血吸虫病的治疗或制备抗血吸 虫病免疫毒素。本发明涉及基因工程技术和血吸虫病的治疗药物领域。

背景技术

血吸虫病是一种严重危害人类健康的寄生虫病，广泛流行于我国长江沿岸的 湖南、湖北、江西、安徽、江苏省和大山区的四川、云南省等地。血吸虫的整个 生活史发育过程比较复杂，尾蚴一旦进入牛羊等哺乳动物的皮肤，变成童虫移行 门静脉系统寄生，22天后发育为成虫寄生于人或哺乳动物的肠系膜静脉中，虫 体移行到肠壁的小血管中产卵。大部分虫卵随血液流入肝脏，另一部分虫卵损害 肠壁掉入肠腔随粪便排出体外。

日本血吸虫尾蚴、童虫、成虫和虫卵等阶段均可对人体产生不同程度的损伤 和复杂的免疫病理反应。一般来说，尾蚴、童虫、成虫所致的损伤，多为一过性 或较轻微，而虫卵沉积于肝、肠等组织内诱发的虫卵肉芽肿及随之发生纤维化是 血吸虫病的主要病理基础。血吸虫抗原成分，如肠相关抗原、膜相关抗原和可溶 性虫卵抗原以及虫体代谢或死亡产物，都可引起机体变态反应性损伤。

目前血吸虫病的治疗以吡喹酮化疗为主，虽然吡喹酮的治疗可取得可靠疗 效，但急性血吸虫感染死亡时有发生，慢性血吸虫病肝脏纤维化尚无有效的治疗 方法，可引起显著的门脉高压，由此导致的上消化道出血、脾肿大、腹水，是引 起患者死亡、丧失劳动力的主要原因。另外，单一化疗药物的长期使用可能出现 耐药性问题，长期应用还有可能诱发抗药虫株。因此，血吸虫病的治疗仍然存在 很多问题，直接影响国家的投资环境，影响和谐社会和小康社会的建设。所以， 探索新的高效低毒的血吸虫病治疗药物就显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是针对上述不足之处提供一种抗血吸虫单克隆抗体NP11-4单 链抗体及其制备方法、应用，是利用基因工程技术提取抗日本血吸虫表膜单克隆 抗体细胞株NP11-4总RNA，RT-PCR方法扩增V_H、V_L基因，利用重叠延伸PCR将 V_H和V_L基因以V_H-linker-V_L形式连接成单链抗体基因，将单链抗体基因与 pBAD/gIII A载体连接，克隆至大肠杆菌Top10F’，诱导目的蛋白可溶性表达。 该蛋白应用于血吸虫病的治疗药物领域。

本发明抗血吸虫单克隆抗体NP11-4单链抗体及其制备方法、应用，制备了 定位于日本血吸虫成虫表膜、尾蚴膜、童虫膜、虫卵卵壳及卵内毛蚴膜的单克隆 抗体NP11-4，通过培养NP11-4杂交瘤细胞，提取细胞总RNA，经逆转录后用PCR 的方法扩增NP11-4可变区基因，进行基因工程抗体改造，制备成抗血吸虫单克 隆抗体NP11-4单链抗体。主要应用于制备抗血吸虫病免疫毒素及治疗血吸虫病 药物领域。

一种抗血吸虫单克隆抗体NP11-4单链抗体，即抗血吸虫单克隆抗体NP11-4 单链抗体N端从第1个氨基酸到第122个氨基酸为单链抗体的重链可变区(V_H)， 从第141个氨基酸到第254个氨基酸为单链抗体的轻链可变区(V_L)，两者之间 由重复的甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)18个氨基酸组成的短肽以V_H-linker-V_L的形式连接，全长254个氨基酸，其氨基酸序列为：

Leu Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser

Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe Trp Leu Gly

Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Tyr Pro