[发明专利]一种利用精蛋白硫酸盐提高基因转染猪皮转染效率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种提高携带外源基因的 重组腺病毒载体转染猪皮效率的方法。

背景技术

烧伤是一类发生率及致残率均较高的特殊类型创伤，其根本问题就 是创面问题，如果烧伤创面得不到及时有效的覆盖、封闭，必将引起患 者机体内环境的紊乱、感染及多脏器功能障碍的发生；此外，还可能出 现创面的非生理性愈合，使疤痕形成增加，残疾程度加剧。因此，对烧 伤创面进行皮肤移植的研究是现代烧伤治疗的迫切需要；也是烧伤研究 的热点及难点。

深度烧伤创面需经皮肤移植才能愈合，而大面积、特大面积烧伤患 者自体皮源严重不足，需经非自体(同种异体或异种)皮覆盖创面方能取 得较好的临床效果，同种异体皮(主要是尸体皮)是目前烧伤创面治疗中 公认效果较好的生物敷料，但由于来源和伦理等多种条件限制，同种异 体皮无法满足临床需求。猪皮由于与人皮在组织结构和生理功能上的高 度相似性，是临床使用最为广泛的异种皮肤，但由于猪和人之间的种属差 异，其排斥反应比较严重，无法起到长期覆盖作用。

专利申请号为00103528.2，发明名称是“一种用重组基因转染的异 体皮肤”的专利申请公开了利用传统的Ad5腺病毒载体携带免疫抑制基 因CTLA4Ig对猪皮肤进行体外转染，可使CTLA4Ig蛋白在猪皮组织活细 胞内表达，从而起到抑制免疫排斥的发生，在烧伤创面诱导移植皮肤局 部特异性免疫耐受，达到延长移植异种皮肤成活的目的。

但是，由于Ad5腺病毒载体和被转染细胞表面均带负电荷，相互之间 存在静电排斥力，所以上述利用Ad5腺病毒载体携带免疫抑制基因 CTLA4Ig对猪皮肤组织细胞的转染效率较低，需要较高滴度的病毒感染才 能发挥效果，使得基因转染猪皮的生产成本较高。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高基因转染猪皮转染效率的方法，该方 法可以提高Ad5重组腺病毒载体对猪皮肤细胞的转染效率。

实现本发明目的的技术方案如下：

一种利用精蛋白硫酸盐提高基因转染猪皮转染效率的方法，包括如 下步骤：

1)制备待转染的猪皮肤；

2)使用浓度为500-10000μg/ml精蛋白硫酸盐对10⁸PFU/ml Ad5重组 腺病毒载体进行震荡混合，孵育后制备成转染液；

3)将步骤2)制备的转染液对步骤1)制备的猪皮肤进行转染。

其中，步骤1)所述猪皮肤是任何一种品系的猪皮肤，优选巴马香猪 皮肤，进一步优选小于6个月猪龄的猪皮肤，最优选4-6月龄的巴马香 猪皮肤。所述猪皮肤的厚度为0.1-1.0毫米，优选0.4-0.6毫米。

其中，步骤2)中所述Ad5重组腺病毒载体含有CTLA4Ig重组基因， 可按照专利申请号为00103528，发明名称是“一种用重组基因转染的异 体皮肤”的专利申请公开的方法制备CTLA4Ig重组基因和含有CTLA4Ig 重组基因的Ad5腺病毒载体。

其中，步骤2)中所述孵育具体为：4℃孵育10-20分钟。

其中，步骤3)中所述转染具体是在CO₂培养箱内37℃转染1-3小 时。

其中，步骤3)具体为：将步骤2)中处理后的转染液按0.8-2.2ml/cm²的比例对步骤1)中处理后的猪皮肤在CO₂培养箱内37℃转染1-3小时。

其中步骤3)优选将步骤2)制备的转染液按1ml/cm2的比例对步骤1) 制备的猪皮肤在CO2培养箱内37℃转染2小时。

鱼精蛋白发现于1870年，Miller等于1942年，Negronl和Fisher 等于1944年研究发现鱼精蛋白具有阻止细菌生长的功能后，鱼精蛋白作 为化学防腐剂的替代品正式用作抗菌剂的研究才盛行起来。

鱼精蛋白是一种在鱼类精核中发现的聚阳离子抗菌短肽，可溶于水 和稀酸，加热不凝固。从分子组成上看，鱼精蛋白分子中的32个氨基酸 中有21个Arg，多为阳离子，不具有既亲水又亲脂的特性，因而无法插及 细胞膜内形成膜通道，所以鱼精蛋白不会引起细胞的水解或改变细胞的 通透性。