[发明专利]病毒纯化方法

说明书

本申请为于2001年9月25日提交的发明名称为“病毒纯化方法” 的200580005682.4号中国发明专利申请的分案申请。

发明领域

本发明属于从宿主细胞中纯化病毒、特别是纯化重组腺病毒的领 域。

发明背景

病毒，无论是天然发生的还是其重组形式的，均可用于疫苗接种 和基因治疗领域。许多病毒或者病毒样颗粒可以安全而有效地在宿主 细胞中增殖(见例如WO 01/38362，其描述了各种病毒在宿主细胞E1 永生化的视网膜细胞中的增殖)。重组腺病毒是用于基因治疗和疫苗 接种的一类优选的病毒载体。这些重组腺病毒通常至少在E1区域具 有缺陷，并在提供E1区域的互补细胞(例如293细胞)或者E1-永生化 的视网膜细胞如PER.C6^TM细胞中增殖(见例如美国专利5,994,128)。

病毒在宿主细胞中增殖之后，基本上对于所有应用，在进一步应 用之前均需要从宿主细胞中纯化病毒。

国际专利申请WO 98/22588描述了生产和纯化腺病毒载体的方 法。所述方法包括培养宿主细胞、用腺病毒感染所述宿主细胞、收获 并裂解宿主细胞、浓缩粗制裂解物、更换所述粗制裂解物的缓冲液、 用核酸酶处理该裂解物、以及使用层析进一步纯化病毒。

一些其它出版物描述了从宿主细胞中纯化病毒的方法，大多数注 重使用特异性层析基质从宿主细胞裂解物中纯化病毒，见例如美国专 利6,008,036、6,586,226、5,837,520、6,261,823、6,537,793和国际专 利申请WO 00/50573、WO 02/44348和WO 03/078592所述。

大多数所述方法应用核酸酶处理步骤降解DNA杂质。尽管一些 方法描述了不同的层析基质，但仍需要从宿主细胞培养物中纯化病毒 的替代及优选改良方法。本发明提供了这样的方法。

附图描述

图1：已知的收获细胞方法(T/B)与本发明的方法(B/T)的示意图， 见实施例1所述。T：Triton，B：Benzonase，p.i.：感染后。

图2：在T/B及B/T方法(示意图见图1)后澄清除去宿主细胞蛋 白。图中示出了5个单独纯化的处理中样品(in process samples)的 银染SDS-PAGE(4-12％bis-tris NuPAGE，Invitrogen)分析(样品见实施 例1和表1所述)。第2组来自T/B收获方法，其中裂解后加入核酸 酶；第3-7组来自B/T收获方法，其中核酸酶在裂解之前加入。将 收获物(泳道1)通过0.5μm Clarigard滤膜(泳道2)澄清，随后用 0.8/0.45μm Sartopore 2滤膜(泳道3)过滤。M：标记物，以kD表示的 M_w在旁边示出。

图3：在处理期间用高盐渗滤除去组蛋白(见实施例2)。图中示 出了银染SDS-PAGE。

A.渗透物，样品：1：初始渗透物；2：4x浓度之后；3：第1个DFV 0.3M NaCl；4：第3个DFV 0.6M NaCl；5：第4个DFV 0.6M NaCl； 6：第5个DFV 1.0M NaCl；7：第6个DFV 1.0M NaCl；8：第7个 DFV 0.3M NaCl；9：第9个DFV 0.3M NaCl。M：标记物，以kD表 示的M_w在旁边示出。

B.渗余物，样品：1：起始样品，2：4x浓度之后；3：第1个DFV 0.3M NaCl；4：第2个DFV 0.6M NaCl；5：第6个DFV 0.6M NaCl； 6：第7个DFV 1.0M NaCl；7：第8个DFV 1.0M NaCl；8：第9个 DFV 0.3M NaCl；9：第9个DFV millex(样品8的0.22μm过滤物)。 M：标记物，以kD表示的M_w在旁边示出。

图4：本发明优选方法的示意图(见实施例1)。

图5：从重组病毒制备物中除去埃博拉病毒核蛋白(NP)(见实施 例3实验3.1详述)。图中示出银染SDS-PAGE(4-12％bis-tris NuPAGE， Invitrogen)。A：起始材料，B：与1％Tween 20温育，C：与2.5M NaCl 温育。箭头表示NP。

图6：从重组病毒制备物中除去埃博拉病毒核蛋白的实验(见实施 例3实验3.3详述)。