[发明专利]一种诱导神经干细胞定向分化的方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种诱导神经干细胞定向分化的方法，具体涉及一种利用成体干细胞系诱导神经干细胞定向分化的方法。

背景技术

神经干细胞在神经组织损伤修复的治疗中具有广阔的应用前景，神经干细胞主要来源于胚胎组织及成体组织细胞。成体干细胞包括造血干细胞、神经干细胞、肝脏干细胞、皮肤干细胞、肌肉干细胞等等。

目前成体非神经组织来源的干细胞经诱导、定向分化为神经干细胞的研究报道逐渐增多，主要集中子骨髓、脂肪、皮肤等组织，其中以骨髓来源的成体神经干细胞方面的研究较多。其主要方法是抽取动物或人体骨髓，分离获取多潜能性的骨髓基质细胞，通过诱导分化、纯化等获得神经干细胞。来源于骨髓的成体神经干细胞具有来源充足，获取容易，同时自体骨髓来源的成体神经干细胞移植无免疫排斥反应和避免了伦理争议。但是诱导骨髓基质细胞定向分化为神经干细胞的技术难度大，不确定因素甚多，目前常用的维甲酸、神经生长因子等方法诱导骨髓基质细胞定向分化为神经细胞极易丧失干细胞特性、细胞凋亡率极高，这极大地限制了理论研究及临床应用价值。因而，建立安全的神经干细胞定向诱导技术并建立有实用价值的成体神经干细胞系成为神经干细胞研究和应用关注热点。

发明内容

本发明的目的就是提供一种诱导神经干细胞定向分化的方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案，本发明包括如下步骤：

1、成体干细胞系的建立，无菌条件取实验动物胚胎组织分离纯化获得的成体干细胞，经数十代至上百代的培养传代而建成不同的干细胞系；

2、MSCS的定向诱导，更换培养液2天后换液并添加0.01～100mMOL/L的单唾液酸四己精神经节育脂，分别诱导；

3、SCS和诱导细胞形态学观察；

4、免疫细胞化学染色，诱导细胞分别用巢蛋白、NSE、GFAP抗体进行细胞免疫荧光染色。

有益效果：

本发明方法经形态学和免疫细胞化学染色证明，采用脑源性膜信号相关物质一神经节青脂能高比例地诱导成体干细胞定向分化为神经干细胞、神经前体细胞。经诱导后的神经前体(干)细胞、神经细胞经静脉输注移植或脑内移植具有治疗帕金森病或综合征、中风及其后遗症、脊髓损伤及其后遗症、阿尔茨海默病(老年性痴呆)等作用。具有广泛临床应用前景。

具体实施方式

实施例一

1、成体干细胞系的建立，首先分离从多种胚胎组织来源的成体干细胞，经纯化后在体外无血清条件下传代20～40代培养，建立包括造血于细胞、神经干细胞、肝脏于细胞、皮肤干细胞、肌肉干细胞等成体干细胞系。细胞要求生长状态良好，每3～4大传代一次，无细菌、支原体等污染；传代细胞需经细胞遗传学、克隆形成实验、裸鼠致瘤实验等的检测，证实其为正常生长状态的细胞。

2、MSCS的定向诱导：更换培养液2天后换液并添加0.01～100mMOL/L的单唾液酸四己糖神经节着脂(GMI)分别诱导1，3，5，7，14，28天；对照组仅以含2％B27的Neurobasal培养液继续培养相同时间。

3、MSCS和诱导细胞形态学观察：培养的MSCS经4-6次传代后基本除去非MSCS，此时的MSCs呈单层、贴壁、巢状趋势生长，胞体以长梭形为主，GDla染色阳性，经GMI诱导后细胞出长校形大胞体逐渐演变为小跑体、多突起细胞，其胞体折光性明显增强，部分细胞间可见突起连接、细胞核和核仁，形态学证明为神经干细胞。

4.免疫细胞化学染色：免疫细胞化学染色前细胞用4％的多聚甲醛固定并加PBS、于4℃保存。所有细胞染色均按相应试剂说明的方法进行。诱导细胞分别用巢蛋白、NSE、GFAP抗体进行细胞免疫荧光染色，特异性抗体标记显示诱导细胞为神经前体(干)细胞或神经细胞。

5、诱导细胞移植治疗的临床应用：经诱导后的神经前体(干)细胞、神经细胞经静脉输注移植或脑内移植具有治疗帕金森病或综合征、中风及其后遗症、脊髓损伤及其后遗症、阿尔茨海默病(老年性痴呆)等作用。