[发明专利]核酸分析器件以及使用其的核酸分析装置

说明书

技术领域

本发明涉及核酸分析器件以及使用其的核酸分析装置。

背景技术

作为核酸分析器件，正在不断开发确定DNA或RNA的碱基序列的新技术。

现在，就通常使用的利用电泳的方法而言，预先由序列确定用的DNA片段或RNA试样进行逆转录反应，制备出合成的cDNA片段试样，通过周知的sanger测序法进行双脱氧反应，然后进行电泳，计测分子量分离展开图案来进行解析。

与此相对，近年，如非专利文献1所述，有人提出了在基板上固定DNA等来确定其碱基序列的方法。该方法为，在基板表面1分子1分子地随机捕捉要分析的试样DNA片段，大致1个碱基1个碱基地使其延长，通过荧光计测来检测其结果，从而确定碱基序列。具体来讲，以下述工序作为1个循环：采用4种dNTP的衍生物(MdNTP)进行DNA聚合酶反应的工序，所述4种dNTP的衍生物作为DNA聚合酶的底物被组入模板DNA，由于保护基的存在可停止DNA链延伸反应，并且还具有可检测的标记；接着，用荧光等检测被组入的MdNTP的工序；以及将MdNTP恢复到可延伸的状态的工序，通过反复该循环，确定试样DNA的碱基序列。在本技术中，由于能够一分子一分子地确定DNA片段的序列，因此，可以同时解析大量的片段，可以增大解析能力。另外，本方式存在能确定每个单一DNA分子的碱基序列的可能性，因此，可能不需要对克隆或PCR等操作的DNA进行精制、扩增，这些步骤是以往技术中的问题，从而可以期待基因组解析好基因诊断的快速化。

非专利文献1：P.N.A.S 2003，Vol.100，pp.3960-3964.

非专利文献2：Physical Review Letters 2006，96，pp 113002-113005.

非专利文献3：Anal.Chem.Vol.78，6238-6245.

非专利文献4：Nanotechnology，2007，vol.18，pp 044017-044021.

非专利文献5：J.Coput.Theor.Nanosci.2007，vol.4，pp 686-691.

非专利文献6：Nanotechnology，2006，vol.17，pp 475-482.

非专利文献7：P.N.A.S 2006，Vol.103，pp 19635-19640.

发明内容

发明要解决的问题

利用基板上的延伸反应解析碱基序列时，以在所述非专利文献1中公开方式为代表，通常将单碱基延伸反应·未反应底物的洗涤·计测作为一个循环，即，逐次反应方式。对每个单一DNA分子解析碱基序列时，计测探针DNA上的一分子荧光色素的荧光，所述荧光色素是通过单碱基延伸反应而被组入DNA双链中的核苷酸所附带的，但是，在通常的荧光测定中，不能识别探针DNA上被捕捉的荧光分子与在其附近浮游的未反应的核苷酸所附带的荧光色素。因此，每延伸一个碱基后，都必不可少地要洗涤未反应底物。由于加入该洗涤工序，就存在如下问题：需要在基板上形成复杂的流路或送液装置以及废液处理装置；还要大量地消耗反应试剂；进一步，整个解析所需要的反应时间也加长。

为了识别探针DNA上被捕捉的一分子荧光色素与未反应底物的荧光分子，必须要做出这样的条件，即，只加强在探针DNA上被捕捉的荧光色素的发光，减弱浮游的色素的发光以达到不发光或忽视的程度。

本发明的目的是识别通过碱基延伸反应而被组入DNA双链中的核苷酸所附带的一分子荧光色素与未反应底物的荧光分子。

解决问题的方法

因此，本发明人等经过潜心研究，结果发现了以下方法：通过在探针DNA上或核酸合成酶上形成基于局域表面等离子体振子的强荧光增强场，可以识别、计测通过单碱基延伸反应而被组入DNA双链中的核苷酸所附带的荧光色素与浮游的色素。特别深入研究了制作出强荧光增强场的金属结构体的形状、和在被局域化的增强场内固定探针DNA或核酸合成酶的方法，发现了使两者并存的方法。

本发明涉及利用荧光测定来分析试样中的核酸的核酸分析器件，其通过光照射产生局域型表面等离子体振子，并且，用于分析试样中的核酸的核酸探针或核酸合成酶被配置于所述表面等离子体振子的产生部位。

发明效果

根据本发明，可有效地引起由表面等离子体振子所产生的荧光增强效果，并且，可将DNA探针或核酸合成酶固定于荧光增强效果所涉及的区域，因此，即使不除去带有荧光分子的未反应底物，也能够计测碱基延伸反应。

附图说明

图1是用于说明本发明的核酸分析器件的概念的图。