[发明专利]一种聚丙烯酰胺凝胶的银染方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种聚丙烯酰胺凝胶的银染方法。

背景技术

由于聚丙烯酰胺凝胶电泳使用样品量少、不易扩散，具有较高分辨率且易于观察，目前已经广泛使用在分子标记研究和遗传图谱构建的过程中。常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳后的银染过程主要包括以下步骤：(1)电泳后的凝胶从玻板中取出放入装有蒸馏水的瓷盘中，用蒸馏水漂洗2次。(2)固定凝胶：向盘中加入10％的乙醇固定液浸没凝胶，放在摇床上轻轻摇20min，倒去固定液，用蒸馏水漂洗2次。(3)凝胶氧化：加入1％的硝酸氧化5min，硝酸回收，用蒸馏水漂洗2次。(4)银染凝胶：加入0.1％的硝酸银染色液浸没凝胶，放在摇床闭光轻轻摇30min，倒去液体，用蒸馏水漂洗2次。(5)凝胶显影：向瓷盘中加入2％的碳酸钠显色液浸没凝胶，边摇边观察，直到凝胶上显现清晰的电泳条带。(6)终止显影：条带清晰后迅速倒出显色液，尽快加入4％的乙酸停显液浸没凝胶，停止显色反应。(7)停显后，加入蒸馏水浸没凝胶。(8)凝胶摄影：用数码相机对凝胶进行照相，如图1所示，整个银染过程完成。全部过程虽然解决了聚丙烯酰胺凝胶电泳后的银染、显影过程，操作简单、使用方便，但所需时间较长，分辨率较低，大批量试验更是费时、费力，严重影响了试验的进展。如何改进现有的银染方法，建立一种快速、高效的银染显带方式、提高银染效率是本发明所要解决的问题。

发明内容

鉴于上述现有银染方法中的不足，本发明旨在提供一种银染时间短、条带清晰的聚丙烯酰胺凝胶的银染方法。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种聚丙烯酰胺凝胶的银染方法，包括以下步骤：

(1)将电泳后的凝胶放入装有蒸馏水的瓷盘中，用蒸馏水漂洗2次；

(2)银染：加入染色液进行银染，然后用蒸馏水漂洗2次；

(3)显影：加入显影液进行显色；

(4)凝胶摄影：用数码相机对凝胶进行照相。

所述染色液包括0.2％的AgNO3、1％的冰醋酸和10％的无水乙醇。

所述银染时间为5~20min。

所述银染时间最好为10min。

所述显影液包括3％的无水NaOH和0.5％的甲醛。

所述显影时间为8min。

所述蒸馏水也可为去离子水。

本发明所述的一种聚丙烯酰胺凝胶的银染方法，通过简化银染步骤、减少了溶液配制的种类，简化了显色程序，节约了试剂的用量，降低了成本，在保证得到理想目的条带的前提下，大大缩短了显色时间，提高了染胶效率，得到的目的片段清晰，非常利于基因型的判定。

附图说明

图1为常规银染方法的银染结果图；

图2为本发明银染方法选用银染时间为20min的银染结果图；

图3为本发明银染方法选用银染时间为15min的银染结果图；

图4为本发明银染方法选用银染时间为10min的银染结果图；

图5为本发明银染方法选用银染时间为5min的银染结果图。

具体实施方式

本发明的中心思想是在提高银染速度、简化操作步骤的前提下，保证银染效果、得到清晰条带为目的的。

本发明采用SSR标记作为实验方法，引物采用Genebank上发布的尼罗罗非鱼引物UNH817(登录号：G64035)如下：

正向引物序列：CCTCTTTCTGTGGGTTTCTCC

反向引物序列：CCCAGCCTGCAGTGATACTT

反应体系总体积为15μL，其中10×Buffer 1.5μL，10mmol/L dNTPs 0.2μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，10μmol/L的上下游引物各0.5μL，DNA模板0.2μL，ddH2O 11.9μL。PCR扩增程序为94.0℃预变性5min，然后经34个循环，每个循环94.0℃变性30s，52.0℃退火30s，72.0℃延伸1min，最后72.0℃延伸10min，在4℃保存。采用12％(39∶1)的聚丙烯酰胺凝胶，在150V电压下电泳4小时。

本发明所述的一种聚丙烯酰胺凝胶的银染方法，将电泳后的上述凝胶放入装有蒸馏水的瓷盘中，用蒸馏水漂洗2次，加入染色液进行银染，染色液包括0.2％的AgNO3、1％的冰醋酸和10％的无水乙醇，银染时间为5～20min，银染时间最好为10mm，然后用蒸馏水漂洗2次，再加入显影液进行显色，显影液包括3％的无水NaOH和0.5％的甲醛，显影时间为8min，此时出现较好的银染效果，用数码相机对凝胶进行照相，完成银染过程。其中，使用的蒸馏水也可为去离子水。

实施例一