[发明专利]一种可视化结核抗体检测蛋白芯片、制备方法及用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种可视化多靶点结核抗体检测蛋白芯片，具体涉及一种多靶点结核抗体检测的蛋白芯片，还涉及该芯片的制备方法及医疗用途。 

发明背景 

近年来，结核病死灰复燃，全球大约1/3的人口感染结核杆菌，每年死于结核病的人数约300万人。我国第四次结核病流行病学抽样调查报告显示，我国现有活动性肺结核患者451万，菌阳肺结核患者196万。而且近年来我国结核病感染人数呈逐渐上升趋势，其数量居传染病首位。因此，结核病的早发现、早诊断、早治疗显得尤为重要。传统的细菌学诊断技术是结核病诊断的“金标准”，被沿用至今，但由于它存在检测耗时长、敏感性低、特异性较差等缺点，一直难以满足临床诊断的需要。血清学免疫诊断技术由于其操作简便、快速、稳定性好等固有优势，仍然是结核病辅助诊断的重要工具。然而，目前结核抗体检测试剂在特异性和敏感性方面仍存在一些问题，主要原因是所采用的抗原不能满足高特异敏感性诊断试剂的要求。在先前的研究中，我们克隆表达了七种特异性强并具有互补性的结核杆菌抗原(38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtb16.3)，在本研究中我们进一步通过生物信息学软件分析筛选优势表位，并成功克隆表达了优势表位抗原。利用这些优势表位抗原研制成检测结核抗体的可视化抗体检测蛋白芯片。该方法与传统痰涂片和痰菌培养方法相比，大大提高了结核病检测的敏感性和特异性，有望用于结核病辅助诊断。 

38kD抗原是一种脂蛋白和主要免疫原，是目前最为常用的结核病诊断抗原之一。WilKinson报道用38kD抗原检测肺结核病人血液，敏感性与特异性分别为65.6％和95.8％(J Clin Microbiol，35(3)：553-557(1997))。 

早期分泌性抗原性靶(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP10)是结核病免疫诊断中两个很有前途的抗原，具有较强的细胞免疫活性，在抗结核感染的免疫回忆应答中起重要作用。这两个抗原均由RD1区编码，该区只存在于致病性结核杆菌基因组中，所有BCG菌株基因组中均缺乏该区域。联合应用ESAT-6和CFP10诊断结核病发现混合抗原敏感性较单抗原增加，而不降低其特异性。所以，ESAT-6和CFP10可有望成为诊断动物和人致病性结核杆菌感染的特异性抗原。 

MPT64是结核杆菌生长最早分泌的主要蛋白，仅在结核杆菌及牛型杆菌中存在。虽然Lyashchenko等的研究结果表明，以MPT64蛋白作为抗原检测抗结核抗体的阳性率在各种结核杆菌分泌性蛋白中是较低的，但如果与其它蛋白形成融合蛋白则有可能具有较好的稳定性(Clin Diagn Lab Immunol，7(2)：155-160(2000))。因此，MPT64蛋白有希望成为结核病血液学诊断的组合抗原的候选者之一。 

Mtb8.4(Rv1174c)、Mtb8(Rv0379)和Mtb16.3(Rv2185c)广泛存在于结核杆菌中，其在结核病诊断方面的意义仍然不清楚。Mtb8.4是新近从结合杆菌培养物滤液中纯化分离得到的一种的低分子量蛋白抗原，Coler等学者的研究更进一步揭示Mtb8.4是患有潜伏结合杆菌感染的个体中重要的免疫活性T细胞抗原，在确定致病性结合杆菌感染中具有重要作用(J Immunol.，161：2356-2364(1998))。Mtb8可能是转运蛋白质，仅在Houghton的研究中将Mtb8与其它几种抗原(Mtb11、Mtb48、38kD等)组成融合抗原用于检测结核病，表明Mtb8与其它 几种抗原一起有可能增强38kD抗原的反应活性(Clin Diagno Lab Immun，9(4)：883-891(2002))。而Mtb16.3是一种未知功能蛋白质，有研究表明Mtb16.3与Mtb9.7组合有助于提高对与HIV混合感染的结核病患者的检出率。 

不同结核杆菌抗原检测同一病人血液，其反应性有所不同，而且各抗原之间存在一定的互补性。其原因可能在于结核杆菌抗原多而复杂，在宿主体内表达的数量、种类或时机可能随病人的个体免疫背景和病程而异，表现出不同的抗体谱。因此，将多种抗原制备成蛋白芯片，联合检测可以在保证特异性的基础上有助于提高检测敏感性，是研制高特异性和高敏感性诊断试剂的发展方向。